何曉杰，蘇 娃，王振寶，巴音查汗

（1.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2.伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

新孢子蟲病（Neosporiasis）是由犬新孢子蟲（Neospra caninum）引起的一種原蟲病，主要寄生于牛、犬、羊等多種哺乳動物細胞內(nèi)[1-2]，引起牛、犬、羊等動物的神經(jīng)肌肉性疾病和流產(chǎn)，尤其是奶牛的流產(chǎn)，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的健康發(fā)展。犬新孢子蟲病在世界范圍內(nèi)流行，是牛和犬的一種嚴(yán)重疾病[3]。歐洲、美洲、澳大利亞、新西蘭等地都有發(fā)生，我國周邊的日本、韓國等國家和我國臺灣地區(qū)都有報道，感染率10%～40%，最高可達82%，給養(yǎng)牛業(yè)的生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展。于晉海等[4]分別檢測了312份來自國內(nèi)10個?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）的牛血清，結(jié)果表明，新抱子蟲抗體陽性率為34.4%，證明我國奶牛感染新孢子蟲病比較普遍。

奶?？梢酝ㄟ^消化道感染犬新孢子蟲，犬口服組織包囊后可產(chǎn)生未孢子化的卵囊，卵囊在宿主動物體外24 h可孢子化，奶牛在采食了被新孢子蟲卵污染的飼料或飲水后被感染，也可通過哺乳而感染[5]。目前，胎盤感染是唯一被證實的垂直傳播途徑[6]，使得母畜連續(xù)多次懷孕中將新孢子蟲傳染給胎兒。迄今為止，還沒有防治新孢子蟲病的有效藥物和疫苗，檢出病牛后，淘汰牛只及其他輔助措施是當(dāng)前僅有的防治方法，新孢子蟲病的早期診斷對有效控制該病發(fā)生和蔓延具有重要意義。新疆伊犁是我國重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地之一，奶牛業(yè)發(fā)展迅速，為了解伊犁地區(qū)是否存在新孢子蟲病，本試驗采用間接ELISA方法對伊寧市及周邊地區(qū)的奶牛進行了血清學(xué)調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清

新孢子蟲地方蟲株SRS2重組抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽、陰性血清，均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院巴音查汗教授采用新孢子蟲新疆株制備，惠贈于伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 待檢血清

101份待檢血液采自伊寧市及其周邊地區(qū)的奶牛牛群，其中A養(yǎng)殖戶（新源縣）30份，B養(yǎng)殖戶（昭蘇縣）21份，C養(yǎng)殖戶（鞏留縣）10份，D養(yǎng)殖戶（伊寧縣）40份；均空腹、頸靜脈采集，采集后擺成斜面，置4℃冰箱5 h，然后放在室溫待血清析出后收集血清，于-70℃冰箱中冷凍保存，待檢。

1.3 主要試劑

HRP-山羊抗牛IgG抗體購于Sigma公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.4 主要儀器

iMark型酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad公司；1575型洗板機購于美國Bio-Rad公司；小型恒溫培養(yǎng)箱購于東京理化器械株式會社；酶標(biāo)板購于上海生工有限公司。

1.5 檢測方法

依據(jù)巴音查汗教授所建立的奶牛新孢子蟲病ELISA檢測方法，應(yīng)用地方蟲株SRS2重組抗原對奶牛血清中新孢子蟲抗體進行檢測。

1.5.1 包被抗原

將新孢子蟲地方蟲株SRS2重組抗原用50 mM碳酸鹽緩沖液（50 mM carbonate-bicarbonate Buffer，pH 9.6）稀釋為0.5 μg/mL，混勻后加入96孔酶標(biāo)板孔里，50 μL/孔，置于4℃過夜。

1.5.2 封閉

吸取洗滌液（0.05%Tween-20的PBS 緩沖液）洗滌，250 μL/孔，洗滌1次后，拍干。加入封閉液（3%脫脂乳的 PBS 緩沖液），100 μL/孔，37℃封閉1 h。

1.5.3 加樣

封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗滌1次，將待檢血清用封閉液按1:100稀釋后，每個樣品平行加到酶標(biāo)板的2個孔中，50 μL/孔，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。同時設(shè)陰、陽性血清對照。

1.5.4 加酶標(biāo)二抗（HRP-山羊抗牛IgG抗體）

將酶標(biāo)板用洗滌液洗滌6次后，加入以1:4 000稀釋的酶標(biāo)二抗，50 μL/孔，置37℃溫箱中溫育1 h。

1.5.5 加顯色液

洗滌同上。洗滌后，吸取顯色液于酶標(biāo)板中，100 μL/孔。（顯色液：0.3 mg/L 的 2，2'-azino-bis，0.1M 檸檬酸、0.2 M 的 PBS 和 0.003%H2O2），室溫暗處放置1 h。

1.5.6 讀數(shù)

用酶標(biāo)儀測定415 nm條件下的吸光度即OD415nm值，進行讀數(shù)。

1.5.7 判定標(biāo)準(zhǔn)

ELISA抗體滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，兩陽性血清對照孔的平均值≥0.1，且兩陰性血清對照孔的平均值＜0.1時試驗成立，兩樣品孔OD415nm平均值≥0.1為陽性，＜0.1為陰性。

2 結(jié)果

2.1 新疆伊犁部分地區(qū)奶牛新孢子蟲病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

應(yīng)用新孢子蟲地方蟲株SRS2重組抗原對101份伊寧及其周邊地區(qū)的奶牛血清樣品進行ELISA檢測，試驗結(jié)果表明，新孢子蟲抗體陽性12份，陽性率為11.9%（見表1）。

從表1可以看出，D養(yǎng)殖戶的奶牛群感染新孢子蟲比較嚴(yán)重，B養(yǎng)殖戶的奶牛群感染率相對比較低。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，A、B、C養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲感染率差異顯著（P<0.05）；A、C養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲感染率差異顯著（P<0.05）；A、D 養(yǎng)殖戶和 B、D養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲感染率差異極顯著（P<0.01）；C、D 養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲感染率差異不顯著（P>0.05）；A、B、C、D 養(yǎng)殖戶的奶牛新孢子蟲感染率差異不顯著（P>0.05）。

2.2 不同年齡奶牛血清中新孢子蟲抗體陽性情況

將101份牛血清樣品的檢測結(jié)果，按不同年齡分組進行比較分析。由下表可知，各年齡段的奶牛均可感染牛新孢子蟲。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，不同年齡段之間的奶牛新孢子蟲的感染差異不顯著（P>0.05）（見表 2）。

3 分析與討論

3.1 在宿主和蟲體相互作用的過程中，蟲體表面蛋白是宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要目標(biāo)，并且蟲體的表面抗原是最佳的診斷試劑[7]。研究表明，新孢子蟲地方蟲株表面蛋白SRS2具有較好的免疫原性，是新孢子蟲病診斷和疫苗研究的重要候選抗原，與用于血清學(xué)診斷的GST NcSAG1t[8]基本相符，因此，認為SRS2重組抗原是檢測奶牛血清中新孢子蟲抗體的重要診斷抗原之一。

3.2 為進一步了解新疆伊犁地區(qū)奶牛新孢子蟲病的感染情況，以便于有效控制該病的發(fā)生和蔓延，本試驗應(yīng)用新孢子蟲地方蟲株SRS2重組抗原作為ELISA診斷抗原，對新疆伊犁部分地區(qū)進行了新孢子蟲病的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明，檢測的4個養(yǎng)殖戶的奶牛群中均不同程度感染了新孢子蟲病，平均抗體陽性率為11.9%，總體來說，不同養(yǎng)殖戶奶牛的新孢子蟲抗體陽性率差異不顯著（P>0.05）。同時本試驗又對1～3歲，4～6歲，7～9歲三個不同年齡段奶牛的新孢子蟲抗體陽性率進行比較分析，發(fā)現(xiàn)三個年齡段的奶牛均可感染新孢子蟲，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異不顯著。從本次的檢測結(jié)果來看，初步說明伊寧及周邊地區(qū)的奶牛牛群中存在新孢子蟲病，各種年齡段的奶牛均可感染，應(yīng)引起重視，加強防范。

3.3 劉晶[9]等利用新孢子蟲體外重組表面蛋白dNcSRS2蛋白作為包被抗原，建立了檢測新孢子蟲血清抗體間接ELISA方法，且與進口的IFAT及兩種商品化ELISA試劑盒的檢測結(jié)果相比較，符合率均達到92%以上，同時對236份奶牛血清的新孢子蟲抗體進行檢測，陽性率為22%。本試驗采用由Chahan B于2003年建立的新孢子蟲病ELISA診斷方法[10]，該方法具有敏感性高，特異性好、操作簡單、快速，且包被的抗原易于保存，可用于大量血清樣品檢測等優(yōu)點，作為有效檢測奶牛新孢子蟲病的血清學(xué)診斷方法之一，在牛新孢子蟲病診斷、流行病學(xué)調(diào)查中已得到廣泛應(yīng)用。

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