謝志勤 ，謝芝勛 ，劉加波 ，龐耀珊 ，鄧顯文 ，謝麗基 ，溫 娟 ，藍(lán)如束 ，張振榮 ，黃海強(qiáng)

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西南寧市動(dòng)物疾病預(yù)防診斷中心，廣西 南寧 530001；3.廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530028；4.廣西武宣動(dòng)物疾病預(yù)防診斷中心，廣西 武宣 545900）

牛結(jié)核?。˙ovine tuberculosis）主要是由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）引起的一種慢性進(jìn)行性傳染病。近年來(lái)，隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥性菌株的產(chǎn)生及養(yǎng)牛的增加，結(jié)核病的陽(yáng)性檢出率也在逐年上升，每年給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，目前世界范圍內(nèi)有5000萬(wàn)頭牛感染了結(jié)核，造成的經(jīng)濟(jì)損失每年達(dá)30億美元[1]。牛分枝桿菌可以傳染給人，危害人類健康。據(jù)報(bào)道，人結(jié)核病人中約有30%是由牛結(jié)核分枝桿菌引起。每年因死于結(jié)核病的人數(shù)在世界范圍內(nèi)就300萬(wàn)，是其他傳染病死亡人數(shù)之和[2]。目前牛結(jié)核病在廣大發(fā)展中國(guó)家仍嚴(yán)重流行，我國(guó)牛結(jié)核的陽(yáng)性率為10%左右。盡管采取了“檢疫、撲殺”的防制策略，但仍未能達(dá)到從根本上控制牛結(jié)核病的目的，近年來(lái)反而呈上升趨勢(shì)[3]。

在檢測(cè)牛結(jié)核病方面，目前已有多種不同的檢測(cè)方法，如變態(tài)反應(yīng)、分離鑒定、ELISA[4]、PCR 檢測(cè)[5]等。應(yīng)用較多的則是傳統(tǒng)診斷方法，即采用結(jié)核菌素皮試（tuberculin skin test，TST）檢測(cè)，通過(guò)皮下注射牛分枝桿菌的純化蛋白衍生物（Purified protein derivative，PPD）造成遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行判斷。PCR檢測(cè)方法是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種快速檢測(cè)方法，在疾病的診斷上已得到廣泛的應(yīng)用。雖然在檢測(cè)牛結(jié)核方面有多種方法，但是對(duì)各個(gè)方法的檢測(cè)準(zhǔn)確性沒(méi)有進(jìn)行比較。本試驗(yàn)試圖通過(guò)應(yīng)用牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)、分離鑒定、PCR檢測(cè)和γ-干擾素檢測(cè)四種方法對(duì)牛群進(jìn)行比較，探尋這四種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及在實(shí)際工作中的應(yīng)用價(jià)值，以找出結(jié)核病污染群的最佳防治和凈化方法，更好地防制水牛結(jié)核病，減少人類結(jié)核病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)及采樣奶水牛場(chǎng)

在廣西南寧、武宣、來(lái)賓、武鳴、合浦等不同地方的奶水牛場(chǎng)進(jìn)行試驗(yàn)及采樣。

1.2 試劑盒和牛型提純結(jié)核菌素

牛結(jié)核菌素購(gòu)自獸藥集團(tuán)生物疫苗有限公司（原黑龍江省生物制品一廠）產(chǎn)品，批號(hào)為200404，規(guī)格為5mL/瓶，凍干型；γ-干擾素試劑盒購(gòu)自北京測(cè)迪科技有限公司，為進(jìn)口產(chǎn)品，批號(hào)為63319。

1.3 主要試劑

Taq 聚合酶、dNTPs、DNA Marker購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司；蛋白酶K購(gòu)自Merker公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）為Promega公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 菌種

牛分枝桿菌C680001滅活菌、牛分枝桿菌BCG抗原，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，牛分枝桿菌分離株mt 359為本室分離并保存。

1.5 培養(yǎng)基

改良羅氏培養(yǎng)基（L-J氏培養(yǎng)基）和丙酮酚培養(yǎng)基按結(jié)核病細(xì)菌學(xué)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行配制。鑒別培養(yǎng)基噻吩羧酸肼（T2H）培養(yǎng)基及對(duì)硝基甲酸培養(yǎng)基（PNB）則由廣西疾病控制中心結(jié)核病科惠贈(zèng)。

1.6 牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)及判定標(biāo)準(zhǔn)

按規(guī)程GB/T18645-2002進(jìn)行試驗(yàn)和判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.7 臨床樣品的采集及處理

用滅菌的棉拭子從牛的鼻腔中挑取鼻黏液，然后用經(jīng)高壓滅菌的PBS將鼻黏液從棉拭子中洗下來(lái)；淋巴結(jié)的處理按1:5（W/V）加滅菌的PBS進(jìn)行研磨。分別取1.5mL上述的鼻黏液洗液、淋巴結(jié)研磨液和牛奶樣品到1.5mL離心管，12000 r/min離心10min，棄上清，沉淀用滅菌的PBS溶液洗滌并離心2次，然后按已報(bào)道的方法[6]進(jìn)行處理和提取核酸DNA。

1.8 分離培養(yǎng)

1.8.1 培養(yǎng)基接種

將已處理的鼻黏液、淋巴結(jié)和牛奶樣品接種L-J氏培養(yǎng)基、丙酮酚培養(yǎng)基。接種后置37℃溫箱平放培養(yǎng)，3 d后直立，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌落的顏色、形狀大小等生長(zhǎng)情況。

1.8.2 涂片鏡檢及鑒別培養(yǎng)

將可疑菌落用萋-尼氏抗酸性染色，染色鏡檢后凡為分枝桿菌陽(yáng)性的細(xì)菌，轉(zhuǎn)管至L-J氏培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。然后用滅菌的PBS溶液洗下來(lái)，按1:100稀釋，然后分別接種于噻吩羧酸肼（T2H）培養(yǎng)基和對(duì)硝基苯甲酸培養(yǎng)基（PNB）。

1.9 γ-干擾素試驗(yàn)

1.9.1 采血

采集單次皮內(nèi)試驗(yàn)陽(yáng)性牛3～30天內(nèi)的血液。將采集的血液（至少5mL）放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒幾次混合血液，使肝素溶解。室溫（22±5℃）下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在采血后30 h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)前輕輕顛倒試管，充分混勻血液樣品。將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭動(dòng)物加三管1.5mL分裝的抗凝血，放37℃培養(yǎng)16～24 h。

?

1.9.2 γ-干擾素試驗(yàn)

吸取經(jīng)刺激抗原（PBS、禽PPD或牛PPD）刺激后約400μL的上層血漿，轉(zhuǎn)入獨(dú)立的1.5mL離心管中，然后按γ-干擾素試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.9.3 γ-干擾素試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

按γ-干擾素試驗(yàn)試劑盒提供判定標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性為牛型提純結(jié)核菌素的OD-陰性抗原的OD≥0.1且牛型提純結(jié)核菌素的OD-禽型提純結(jié)核菌素的OD≥0.1。陰性為牛型提純結(jié)核菌素的OD-陰性抗原的OD<0.1或牛型提純結(jié)核菌素的OD-禽型提純結(jié)核菌素的OD<0.1。

1.10 PCR檢測(cè)

1.10.1 引物設(shè)計(jì)與合成

牛分枝桿菌的引物根據(jù)基因庫(kù)牛分枝桿菌特異性基因（No.MBU87961，gi9954088）設(shè)計(jì)，上游引物 XZmbss5:5'-CTC TGA AAT TCG CCT CTG TAG-3'，下游引物XZmbss65'-TCC GTC TGC ACA CCT TGT GC-3'，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小為631 bp。引物由大連寶生生物工程有限公司合成。

1.10.2 核酸DNA抽提

DNA的提取參照已報(bào)道方法[6]進(jìn)行。

1.10.3 PCR擴(kuò)增

按已報(bào)道方法[6]進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)入94℃1min，56℃ 1min，72 ℃ 1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，最后于4℃停止。

2 結(jié)果

2.1 變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)共檢測(cè)1850頭奶水牛，根據(jù)牛變態(tài)反應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，檢測(cè)陽(yáng)性水牛78頭，陽(yáng)性率為4.21%，其中廣西南寧檢測(cè)720頭，檢出陽(yáng)性牛28頭；武宣350頭，檢出陽(yáng)性牛18頭；來(lái)賓200頭，檢出陽(yáng)性牛7頭；武鳴80頭，檢出陽(yáng)性牛5頭；合浦500頭，檢出陽(yáng)性牛20頭，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 牛分枝桿菌的分離

從78頭皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛采集的樣品中進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌分離，共分離到13株菌，13株菌經(jīng)抗酸染色后進(jìn)行鏡檢，鏡檢為陽(yáng)性的菌轉(zhuǎn)移到鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，根據(jù)在鑒別培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況鑒定出2株為牛分枝桿菌，其余都為非典型分枝桿菌，結(jié)果見(jiàn)表2。

?

2.3 PCR擴(kuò)增

提取78頭結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛樣品的DNA，然后應(yīng)用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果有4份樣品為牛分枝桿菌陽(yáng)性，其余都為陰性。同樣對(duì)分離的13株菌的DNA也進(jìn)行了PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果有2株為牛分枝桿菌陽(yáng)性（圖1）。

2.4 γ-干擾素ELISA檢測(cè)

采集78頭結(jié)核變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛血液，放入含有抗凝劑的試管中，然后對(duì)血樣進(jìn)行γ-干擾素培養(yǎng)；培養(yǎng)后取上清應(yīng)用γ-干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)判定結(jié)果判定有5份為牛分枝桿菌陽(yáng)性，其余均為陰性。

2.5 變態(tài)反應(yīng)、分離鑒定、PCR和γ-干擾素檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)的比較

對(duì)1850頭來(lái)自不同牛場(chǎng)的奶水牛進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性牛78頭，陽(yáng)性檢出率為4.21%（78/1850）；從78頭檢測(cè)陽(yáng)性牛的樣品中經(jīng)分離并鑒定為牛分枝桿菌有2頭，陽(yáng)性分離率為 2.56%（2/78），為全群的 0.11%（2/1850）；PCR 方法檢出陽(yáng)性4頭，陽(yáng)性檢出率是為5.12%（4/78），為全群的 0.22%（4/1850）；而γ-干擾素ELISA檢測(cè)陽(yáng)性5頭，陽(yáng)性檢出率為6.41%（5/78），為全群的0.27%（5/1850）。變態(tài)反應(yīng)的陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)高于PCR、γ-干擾素檢測(cè)和細(xì)菌分離鑒定的檢出率（見(jiàn)表3）。

2.6 變態(tài)反應(yīng)、PCR方法、γ-干擾素檢測(cè)和分離鑒定之間的關(guān)系

78頭變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛，經(jīng)細(xì)菌學(xué)鑒定牛分枝桿菌陽(yáng)性有2頭，PCR檢測(cè)陽(yáng)性牛有4頭，γ-干擾素ELISA檢測(cè)陽(yáng)性有5頭。變態(tài)反應(yīng)、PCR、γ-干擾素ELISA與分離鑒定的符合率分別為2.56%、50%和40%，γ-干擾素ELISA檢測(cè)和PCR檢測(cè)與細(xì)菌分離鑒定的檢出率較接近。

3 討論

本試驗(yàn)中，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的陽(yáng)性檢出率為4.21%，分離鑒定為0.11%；PCR方法為0.22%，而γ-干擾素ELISA方法則為0.27%。從四種檢測(cè)結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，變態(tài)反應(yīng)的陽(yáng)性檢出率比分離鑒定、PCR方法和γ-干擾素ELISA方法的陽(yáng)性檢出率高，這是因?yàn)?其一是與結(jié)核變態(tài)反應(yīng)的特異性差有關(guān)。本試驗(yàn)從變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性的78份樣品中只分離出13株菌，且已證明13株菌中有11株為非典型分枝桿菌，也就是說(shuō)非典型分枝桿菌的存在可以影響變態(tài)反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，造成假陽(yáng)性。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了張喜悅[7]和Lodes[8]報(bào)道的牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)易受人為因素的影響和非典型分枝桿菌感染及患有寄生蟲(chóng)病等非特異性因素的干擾。其二是檢測(cè)牛處于牛結(jié)核發(fā)病初期或隱性期即細(xì)胞免疫期，此時(shí)變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性檢出率要比其它三種方法高；其三是與奶水牛的皮厚有關(guān)，由于奶水牛的皮厚要比黃牛、黑白花奶牛的厚，對(duì)結(jié)核菌素刺激要比黃牛、黑白花奶牛敏感，應(yīng)用現(xiàn)有牛的判定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定，可能會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性率過(guò)高。

本試驗(yàn)中，變態(tài)反應(yīng)與分離培養(yǎng)的符合率很低，只有2.56%。這是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，受機(jī)體的機(jī)能影響，當(dāng)機(jī)體的抵抗力強(qiáng)時(shí)，限制了結(jié)核菌在體內(nèi)的增殖、擴(kuò)散，此時(shí)細(xì)胞免疫是主要的；當(dāng)機(jī)體抵抗力弱時(shí)，病原體向周?chē)鷶U(kuò)散，進(jìn)入血液和體液中，病原體刺激機(jī)體產(chǎn)生大量抗體[9]，此時(shí)應(yīng)以檢測(cè)病原為主。變態(tài)反應(yīng)主要是針對(duì)細(xì)胞免疫期牛結(jié)核的檢測(cè)[10]，而分離鑒定是針對(duì)病原的鑒別檢測(cè)。因此，變態(tài)反應(yīng)與分離培養(yǎng)的符合率較低是符合理論的。

本試驗(yàn)中，PCR方法、γ-干擾素ELISA方法與分離培養(yǎng)的符合率也不高，分別只有50%和40%，但比較接近。這是由于PCR方法是對(duì)牛分枝桿菌的病原核酸進(jìn)行檢測(cè)，不管是活菌還是已死亡的分枝桿菌都能進(jìn)行檢測(cè)，具有較高的敏感性[11]；γ-干擾素ELISA方法也是對(duì)病原進(jìn)行檢測(cè)，主要是對(duì)致敏的淋巴細(xì)胞分泌的γ-干擾素進(jìn)行檢測(cè)。致敏淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下，接受特異性抗原（如PPD等）刺激而活化、表達(dá)并分泌γ-干擾素，再以ELISA對(duì)培養(yǎng)上清中的γ-干擾素進(jìn)行測(cè)定從而達(dá)到檢測(cè)，這種方法同樣具有較高的敏感性[12]。而分離鑒定主要是對(duì)活體病原進(jìn)行體外增值并鑒定，對(duì)已死亡的分枝桿菌是不能應(yīng)用培養(yǎng)基進(jìn)行分離的，因此在實(shí)際檢測(cè)中，PCR方法、γ-干擾素ELISA方法與分離培養(yǎng)的符合率不高也是正常的。

綜上所述，牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)雖然特異性差，易受各種因素的影響，靠單純的變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)并不能最終確定為結(jié)核病牛，但對(duì)于檢測(cè)早期或剛感染牛結(jié)核病的牛，還是起到很大的作用，可以為進(jìn)一步的檢測(cè)確認(rèn)帶來(lái)方便，減少檢測(cè)的盲目性。而分離鑒定雖然是最準(zhǔn)確的一種診斷方法，但是它有一定的局限性，對(duì)樣品要求高，存在鑒定周期長(zhǎng)、繁瑣、對(duì)人威脅大，易受人為或其它環(huán)境因素的影響等不足，不利于對(duì)牛結(jié)核病的快速檢測(cè)。而PCR方法和γ-干擾素檢測(cè)方法與分離鑒定的符合率最接近，二者具有較高的特異性和敏感性。應(yīng)用PCR方法或γ-干擾素檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行牛結(jié)核病的檢測(cè)，不但可以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，還可以加快檢測(cè)的速度，在實(shí)際中可以作為皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的補(bǔ)充檢測(cè)。因此，在對(duì)牛群進(jìn)行牛結(jié)核檢測(cè)時(shí)，應(yīng)首先進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性即采取隔離，然后結(jié)合PCR檢測(cè)方法或γ-干擾素ELISA檢測(cè)方法來(lái)綜合判斷，兩者檢測(cè)陽(yáng)性的牛應(yīng)及時(shí)予以淘汰，這樣經(jīng)過(guò)多次檢測(cè)淘汰，最終達(dá)到凈化牛結(jié)核病的目的。

[1]余大海，韋一然，蔡宏，等.牛結(jié)核病鑒別診斷的方法研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22（10）:932-935.

[2]Dye C D，Scheels S M S，Dolin P D，et al.Global burden of tuberculosis estimated incidence， prevalence，and mortality by country [J].Journal of American Medical Association，1999，282（7）:677-686.

[3]Tollefsen S， VordermeierM，Ulsen I，et al.DNA injection in combination with electroporation:a novelmethod for vaccination of farmed rumi nants[J].Scandinavian Journal of Im-munology，2003，57（3）:229-238.

[4]徐鳳宇，高云航，何昭陽(yáng).ELISA檢測(cè)乳中牛結(jié)核抗體的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（3）:72-73.

[5]劉思國(guó)，王春來(lái)，宮強(qiáng)，等.牛分枝桿菌特異性PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用 [J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（1）:80-83.

[6]謝芝勛，謝志勤，雷劍明，等.結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的二重PCR快速檢測(cè) [J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24（12）:1141-1144.

[7]張喜悅，王君瑋，高云航，等.3種方法檢測(cè)結(jié)核污染牛場(chǎng)的比較[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào) ，2003，23（6）:555-556.

[8]Lodes M J，Dillon D C，Mohamath R，et al.Serological expression cloning and immunological evaluation of MTB48，a novel Mycobacterium tuberculosis antigen [J].J Cli Microbiol，2001，39（7）:2485-2493.

[9]Emmerzaal A，Deleu S.Cattle tuberculosis caused by Mycobacterium bovine is difficult to detect and to treat[J].Veehouderen Dierenarts，2000，14（2）:427.

[10]Miller J M，Jenny A L，Payeur J B.Polymerase chain reaction detection of Mycobacterium tuberculosis complex and Mycobacterium avium organisms in formalin-fixed tissues from culture-negative ruminants[J].Vet Microbiol，2002，87（1）:15-23.

[11]謝芝勛，謝志勤，劉加波，等.多重PCR快速檢測(cè)鑒別牛布魯氏桿菌和牛分枝桿菌的研究與應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23（7）:714-716.

[12]Gormly E，Doyle M B，F(xiàn)itzsimons T，et al.Diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle by use of gamma-interferon assay[J].Vet Microbiol，2006，112（224）:171-179.