王蘊紅 趙明華 梁蕾 張麗琴 席利利 崔秀亭 唐朝樞

1首都體育學院生理生化教研室（北京 100088） 2北京大學醫(yī)學部生理病理系

長期大負荷訓練可引起心臟功能和形態(tài)發(fā)生一系列改變［1］。研究表明，細胞因子 -6（IL-6）家族成員具有調(diào)節(jié)心肌功能和刺激心肌細胞肥大的作用，而JAK/信號轉導和轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路是IL-6家族成員發(fā)揮誘導心肌肥大的主要信號通路［2］。我們以往的研究也提示，急性運動可引起心肌IL-6家族成員之一的心肌營養(yǎng)因子（cardiotrophin-1，CT-1）及其作用通路JAK/STAT的信號分子STAT3表達的改變［3］，這提示JAK/STAT3信號通路可能參與了對運動心臟的功能調(diào)節(jié)。但是JAK/STAT信號通路在長期訓練中是否起調(diào)節(jié)作用，是否參與了運動性心肌肥大的發(fā)生還未見報道。本實驗通過測定耐力訓練大鼠心肌JAK/STAT3信號通路的信號分子JAKs以及JAK/STAT信號通路內(nèi)源性的調(diào)節(jié)蛋白——細胞因子信號抑制因子（suppressors of cytokine signaling，SOCS）的表達，為探討JAK/STAT信號通路在運動誘發(fā)心肌肥大的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠40只（購自北京維通利華實驗動物中心），體重230±5克，二級動物房常規(guī)飼養(yǎng)。大鼠適應環(huán)境后隨機分為安靜對照組（n=10）和耐力訓練組（n=30，在運動訓練過程中死亡11只）。

1.2 運動方案

參照常蕓［4，5］等的大鼠耐力訓練方案，采用 10周跑臺訓練。具體方案是：耐力訓練組大鼠每周訓練6天，周日休息，第一周起始訓練速度15m/min，15min/d，跑臺坡度為10°，之后速度每天平均遞增1m/min，運動時間遞增為2min/d。第2～4周訓練從22m/min，30min/d開始，速度平均增加1m/min，時間增加5min/d直至增加到28m/min，60min/d。第 5～6周：速度保持在 28m/min，運動時間保持在60min/d，分別在10°和15°跑臺上各運動30min。第7～10周：速度從28m/min開始，每天速度平均約增加0.5～1m/min，直至速度增加到34m/min。運動時間保持40～60min/d，跑臺坡度為10°。末次定量負荷運動結束后，分別在運動后即刻和運動后24小時處死，安靜對照組大鼠同時處死。三組中共有11只大鼠在各自運動后不同時間段死亡，未解剖確認具體死因，但可排除運動因素以外的傳染病或環(huán)境因素引起的死亡。

1.3 指標測定

大鼠處死后立即取出心臟，稱全心重量后，計算心系數(shù)（心重/體重）。于大鼠左心室切取心肌置于10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm切片，分別做HE染色和免疫組化染色，免疫組化方法按照試劑盒操作步驟進行。JAK1、JAK3和 SOCS1、SOCS2、SOCS6多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，JAK2購自美國 Cell Signaling公司，其他試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

JAK1、JAK2、JAK3 和 SOCS1、SOCS2、SOCS6 一 抗工作效價分別為 1∶50～1∶100，DAB顯色。陰性對照片以PBS代替一抗，其余步驟相同。應用Leica DMLB顯微鏡（SPOT圖像分析軟件v4.0.2）圖像分析儀，在光鏡10×20倍視野下閱片照相。每張切片分別在心內(nèi)膜下、心肌層和心外膜下隨機選取3個視野，以細胞核呈棕色染色為陽性細胞［6］。雙盲情況下，計數(shù)JAK1、JAK2、JAK3和SOCS1、SOCS2、SOCS6細胞的陽性染色細胞占總細胞數(shù)的比率。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 耐力訓練后大鼠心系數(shù)的變化

本研究結果顯示，大鼠10周耐力訓練后心系數(shù)（3.78±0.29）較安靜對照組（3.32±0.34）顯著增加（P<0.01）。

2.2 大鼠心肌 JAK1、JAK2、JAK3表達

安靜對照組大鼠心肌JAK1、JAK2、JAK3即有少量表達，可見于心內(nèi)膜下、心肌層和心外膜下的心肌細胞以及血管內(nèi)皮的表達，表達部位分布于胞漿和胞核（圖1）。表2顯示，耐力訓練大鼠運動后即刻心內(nèi)膜下、心肌層和心外膜下心肌JAK1陽性細胞率顯著高于安靜對照組（P<0.01）和運動后 24小時組（P<0.05），訓練后24小時組未見明顯升高（P>0.05）。耐力訓練大鼠運動后即刻JAK2陽性細胞率顯著高于運動后24小時組（P<0.05）和安靜對照組（P<0.01），運動后24小時組也顯著高于安靜對照組（P<0.05）。耐力訓練大鼠運動后即刻和24小時JAK3陽性細胞率與安靜對照組比較均無顯著差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠心肌JAK1、JAK2、JAK3陽性細胞率比較（%）

2.3 大鼠心肌 SOCS1、SOCS2、SOCS6表達

安靜對照組大鼠心肌SOCS1、SOCS2表達較少。陽性細胞可見于心內(nèi)膜下、心肌層和心外膜下（圖2）。表3顯示，耐力訓練大鼠心肌SOCS1陽性細胞率在運動后即刻和24小時顯著高于安靜對照組（P<0.05；P<0.01），運動后即刻組與運動后24小時組之間無顯著差異（P>0.05）。SOCS2陽性細胞率在運動后即刻和24小時均顯著高于安靜對照組（P<0.05），運動后即刻與運動24h后無顯著差異（P>0.05）。SOCS6陽性細胞率無論運動后即刻還是運動后24h與安靜對照組相比均無顯著差異（P>0.05）。

表3 各組大鼠心肌SOCS1、SOCS2、SOCS6陽性細胞率比較（%）

3 討論

離體實驗顯示，JAK/STAT信號通路介導了IL-6家族成員調(diào)節(jié)心肌細胞功能和促心肌細胞肥大的作用。當IL-6等細胞因子刺激心肌細胞時，可見JAK/STAT通路的信號分子mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而使用JAK2阻斷劑AG490后，信號分子mRNA和蛋白表達明顯減弱［7］。這一作用在病理性心肌肥大發(fā)生中也得到證實。在慢性壓力負荷誘發(fā)的心臟肥大的發(fā)生中，心肌JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2 表達明顯升高，而當心臟功能失代償時，它們的表達又明顯降低。這提示JAKs的表達及激活變化在誘發(fā)心肌肥大中起著重要的作用，并且能反映心臟功能的變化［8］。我們以往的研究顯示，急性運動也可導致JAK1、JAK2表達以及p-STAT3/STAT3比值的升高［3，4］，表明運動應激也可激活 JAK/STAT通路，并且JAK/STAT信號通路可能參與了運動誘發(fā)的心肌功能和代謝變化的調(diào)節(jié)過程。

本實驗結果顯示，耐力訓練大鼠運動后即刻心肌JAK1、JAK2陽性細胞率顯著升高，說明急性運動仍能誘導耐力訓練大鼠心肌JAK1、JAK2表達提高，耐力訓練所致的心肌功能和形態(tài)的變化可能有JAK/STAT信號通路參與調(diào)節(jié)。此外，耐力訓練大鼠心肌JAK1表達與一次急性運動后JAK1的表達規(guī)律有所不同，一次急性運動后JAK1陽性細胞率升高一直持續(xù)到運動后 24小時［4］，而耐力運動大鼠在運動后24小時心肌JAK1陽性細胞率已下降到安靜對照水平。這提示耐力訓練后大鼠心肌JAK1的表達以及JAK/STAT信號通路對心肌細胞功能的調(diào)節(jié)發(fā)生了適應性改變。而耐力訓練大鼠JAK2表達則持續(xù)較高，提示訓練后JAK2在誘發(fā)心肌功能形態(tài)改變中作用可能是持續(xù)的。

本實驗還觀察到，JAKs家族的另一個成員JAK3的表達不受運動訓練的影響，提示JAK3與JAK1、JAK2在運動中對心肌的作用可能不同。有研究顯示JAK3參與了心臟移植排異反應［9］。

JAKs/STAT信號通路受內(nèi)源性的負性調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)［10］。在對 JAK/STAT通路起負性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)家族中，SOCSs是研究最為廣泛的調(diào)節(jié)蛋白家族。正常情況下，SOCS1、SOCS2等 SOCS mRNA在組織和細胞中均以很低水平存在，而當細胞受到細胞因子等因素的刺激后，SOCS mRNA表達上調(diào)，并且同一種細胞因子可誘導SOCS1、SOCS3 等多種 SOCS 家族成員的表達［11］。體外研究還表明［11］，SOCSs的過度表達可以抑制許多細胞因子的信號傳導。

本實驗結果顯示，耐力訓練大鼠無論在運動后即刻還是運動后24小時，心肌SOCS1、SOCS2陽性細胞率均顯著提高（P<0.05），說明耐力訓練導致其表達長時間維持在較高水平，這與急性運動后心肌SOCS1表達規(guī)律不同［4］，同時，也與疾病誘發(fā)的心肌肥大中的表達規(guī)律不同：發(fā)生慢性壓力負荷導致心臟肥大時，SOCS1表達無明顯變化，只在心衰時明顯升高［8］。上述結果是否提示了運動性心肌肥大與疾病因素誘發(fā)的心肌肥大預后機制不同，還有待進一步研究證實。

SOCSs對JAK/STAT通路的負反饋調(diào)節(jié)機制包括：通過SOCS1、SOCS2結合 JAK1、JAK2等 JAK家族成員，競爭性抑制STAT與活化受體的結合而抑制STAT的激活，以及介導信號蛋白依賴蛋白酶的降解等環(huán)節(jié)，對細胞因子信號傳導起負反饋作用［11］。但這種 SOCS1、SOCS2蛋白表達的升高是否意味著其對JAK/STAT信號通路的抑制作用的提高，從而起到減弱細胞因子誘導心肌肥大的作用，仍需進一步研究。

綜上所述，長期大負荷耐力訓練可引起心肌JAKs和SOCSs表達的改變，這種改變可能在耐力訓練影響心肌功能、代謝變化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

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