史亞麗 蔡德華 王曉潔 杜蓉

1魯東大學(xué)體育學(xué)院（煙臺(tái) 264025） 2魯東大學(xué)食用菌工程研究中心 3魯東大學(xué)生命科學(xué)院

香菇（Lentinus edodes）含有多種有效藥用組分，尤其是香菇多糖（Lentinan，LNT）。它是一種重要的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，通過刺激免疫細(xì)胞成熟、分化和增殖，改善宿主機(jī)體平衡，達(dá)到恢復(fù)和提高宿主細(xì)胞對(duì)淋巴因子、激素和其它生理活性因子的反應(yīng)性[1，2]。LNT對(duì)提高運(yùn)動(dòng)機(jī)體免疫力方面的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)長期進(jìn)行大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠灌胃LNT，觀察補(bǔ)充LNT對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、血清抗體相對(duì)含量及體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量（體液免疫）的影響，探討補(bǔ)充LNT對(duì)長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為其作為運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)補(bǔ)品的研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠120只，雄性，18～22g，山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SYXK（魯）20030020。一級(jí)白色豚鼠，體重 300～400g，山東中醫(yī)藥大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（魯）20050015。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境23℃±2℃，濕度40%～60%，自然晝夜節(jié)律。

1.2 動(dòng)物分組與處理

120只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（C）、運(yùn)動(dòng)組（T）、鹽水 +運(yùn)動(dòng)組（S+T）、高劑量 LNT+運(yùn)動(dòng)組（HL+T）、中劑量 LNT+運(yùn)動(dòng)組（ML+T）、低劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組（LL+T），每組20只。實(shí)驗(yàn)后期死亡14只，T組死亡 3只，S+T組 4只，HL+T組 2只，ML+T組 2只，LL+T組3只。灌胃及訓(xùn)練結(jié)束后將每組小鼠隨機(jī)分為a、b兩小組，a小組進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定，b小組用作血清凝集效價(jià)（抗體相對(duì)含量）測定及體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量測定。

1.2.1 運(yùn)動(dòng)條件

塑料游泳池，100cm×60cm×50cm，水深40cm，超過小鼠體長2倍，水溫32～34℃。

1.2.2 訓(xùn)練方案

C組:不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，只進(jìn)行正常的生理活動(dòng)。T、S+T、HL+T、ML+T、LL+T各組小鼠進(jìn)行 5%負(fù)重游泳訓(xùn)練，持續(xù)4周，6次/周，周日休息。第一周從20min開始負(fù)重游泳，以后每日增加5min直至45min/日，運(yùn)動(dòng)時(shí)間不足45min就發(fā)生力竭的小鼠迅速撈起，擦干身體休息5min后再放入水中繼續(xù)游泳，訓(xùn)練時(shí)間累計(jì)須達(dá)到45min/次。訓(xùn)練結(jié)束后，迅速用電吹風(fēng)吹干身體。

1.3 補(bǔ)充方法

1.3.1 香菇多糖的提取

香菇由魯東大學(xué)食用菌工程研究中心提供。子實(shí)體50℃烘干、粉碎、稱重、熱水浸提、過濾、濾液醇沉得多糖[3]。多糖含量測定方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.3.2 補(bǔ)充方法

采用灌胃法，HL+T組每日劑量400mg/kg，ML+T組200mg/kg，LL+T組 100mg/kg。用生理 鹽水 配制 成400mg/10ml、200mg/10ml、100mg/10ml的 LNT 鹽水溶液，每日0.2ml劑量灌胃，S+T組灌胃等體積生理鹽水。1次/d，時(shí)間為4周。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定

可溶性淀粉6g加入肉湯培養(yǎng)液100ml中，混勻，煮沸滅菌備用。a小組每只小鼠腹腔注射6%可溶性淀粉，1ml/只，當(dāng)日停止訓(xùn)練，繼續(xù)灌胃。3日后于小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.2ml，輕柔腹部，注射后30min于小鼠腹腔注射生理鹽水1ml，輕柔腹部數(shù)次。采集腹水:取小鼠自然站立位。在恥骨前緣，腹中線兩側(cè)剪毛、消毒，浸潤麻醉，緊繃穿刺部位皮膚，作垂直穿刺。用注射器慢慢回抽，滴1滴于潔凈載玻片上，推成薄片，晾干后甲醇固定4～5min。滴加瑞士－吉姆薩染液，染色3min，流水沖洗，自然晾干，油鏡下觀察。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，記錄并計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬指數(shù)=100個(gè)巨噬細(xì)胞所吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)／100；吞噬率=100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)／100×100%[4]。

1.4.2 血清凝集效價(jià)（抗體相對(duì)含量）和體外抗體形成細(xì)胞（PFC）測定（脾臟溶血空斑形成）

于灌胃及訓(xùn)練結(jié)束前第4天，b小組每只小鼠腹腔注射5%SRBC懸液0.2ml致敏，以生成抗體形成細(xì)胞及產(chǎn)生抗體，繼續(xù)灌胃及訓(xùn)練。

（1）血清凝集效價(jià)（抗體相對(duì)含量）測定:灌胃及訓(xùn)練結(jié)束后，將b小組小鼠頭朝下，斷頸采血，血液37℃水浴放置2h，轉(zhuǎn)入冰箱放置2h，分離血清，進(jìn)行抗體凝集反應(yīng)[4]，測定血清凝集效價(jià)。

（2）體外抗體形成細(xì)胞（PFC）測定:按文獻(xiàn)[5]制備豚鼠血清。將b小組小鼠脾臟用生理鹽水制成1×107/ml脾細(xì)胞懸液，取0.1ml脾細(xì)胞懸液和5%SRBC懸液，迅速保溫于47℃水浴中的3.5ml濃度為0.7%瓊脂糖管內(nèi)，搖勻后立即將混合物傾入鋪有底層瓊脂糖凝膠的平皿內(nèi)，輕搖使其鋪開，待瓊脂凝固后，37℃孵育1h。每皿加入 1∶10稀釋的豚鼠血清2ml為補(bǔ)體，使其均勻覆蓋表面。37℃孵育30min，室溫放置1h，4℃冰箱過夜，次日傾去補(bǔ)體，低倍鏡下觀察，空斑中央為淋巴細(xì)胞，周圍為透明區(qū)。計(jì)數(shù)每皿空斑數(shù)，單位為個(gè)/106脾細(xì)胞[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力

4周大負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，T組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)較C組明顯降低。中、高劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率顯著高于鹽水+運(yùn)動(dòng)組和低劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組，中劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)顯著高于鹽水+運(yùn)動(dòng)組和低劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組。

表1 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力比較

2.2 小鼠血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量

4周大負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，T組血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)較C組明顯降低。低、中、高劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組小鼠血清凝集效價(jià)均顯著高于鹽水+運(yùn)動(dòng)組，中劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組小鼠血清凝集效價(jià)顯著高于低劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組；中劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組小鼠體外抗體形成細(xì)胞數(shù)顯著高于鹽水+運(yùn)動(dòng)組和低劑量LNT+運(yùn)動(dòng)組。

表2 各組小鼠血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量比較

3 討論

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)免疫系統(tǒng)及其功能的影響可歸納為兩方面:急性短時(shí)中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)激活免疫系統(tǒng)并提高免疫功能，長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)或長期強(qiáng)化性訓(xùn)練則抑制免疫功能[6]。力竭運(yùn)動(dòng)可抑制腹膜巨噬細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá)，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的抗原呈遞作用，抑制巨噬細(xì)胞的功能[7，8]。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后B細(xì)胞合成和分泌免疫球蛋白的功能出現(xiàn)明顯改變，以75%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)1h，合成與分泌IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白的細(xì)胞功能在運(yùn)動(dòng)過程中和運(yùn)動(dòng)結(jié)束后明顯降低[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率、吞噬指數(shù)、血清凝集效價(jià)、體外抗體形成細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對(duì)照組，表明長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠處于運(yùn)動(dòng)性免疫抑制狀態(tài)。

LNT是一種免疫激活劑，能激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞的趨化性和淋巴細(xì)胞對(duì)Yac-1細(xì)胞和P-815細(xì)胞的毒性反應(yīng)水平[9]。香菇是誘生α-干擾素較明顯的一種真菌，LNT能活化CD4+淋巴細(xì)胞，促使CD4+增殖和IL-2R表達(dá)[10]。LNT可活化T細(xì)胞，并對(duì)免疫巨噬細(xì)胞起誘導(dǎo)和增強(qiáng)作用，使免疫狀態(tài)由低下恢復(fù)到接近于正常。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)充中、高劑量LNT均可使長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率明顯提高，中劑量LNT可使長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)升高且效果明顯好于低劑量LNT。低、中、高劑量LNT均可使長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠血清凝集效價(jià)明顯提高，中劑量LNT效果明顯好于低劑量LNT，中劑量LNT可明顯提高長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠體外抗體形成細(xì)胞數(shù)且其效果明顯好于低劑量LNT。

綜上，4周大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)性免疫抑制。補(bǔ)充LNT可使長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)小鼠非特異性及特異性免疫功能得到改善，其中，中劑量LNT補(bǔ)充效果明顯。

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