劉文倩 張建剛 謝嵐 艾華

北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所（北京100191）

肥胖的發(fā)生發(fā)展主要是能量代謝失衡，攝入的能量超過消耗，多余的能量以脂肪的形式在體內累積的一個過程。增肥容易減肥難，減肥之難在于減肥的頑固艱澀，在于人們在生理和心理上對減肥的抗拒。Ghrelin是近年來新發(fā)現(xiàn)的、對肥胖的發(fā)生發(fā)展起著重要調節(jié)作用的細胞因子[1]，主要由胃組織分泌，下丘腦、垂體、腎臟等處也有少量分泌。給大鼠長時間注射外源性ghrelin后，其攝食量、食物利用率、體重和脂肪含量明顯增加，能量消耗和脂肪利用率顯著降低[2]，因此認為ghrelin可能參與了肥胖發(fā)生的病理生理機制，亦有可能參與減肥的抵抗。本研究通過對營養(yǎng)性肥胖大鼠進行運動和限食減肥，觀察其體內ghrelin的變化，初步探討ghrelin在減肥過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 肥胖大鼠建模

雄性斷乳 SD大鼠 100只，體重 44.0±4.0g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。大鼠隨機分為2組，對照組20只，建模組80只。

1.1.1 飼料組成

普通飼料:碳水化合物50%，蛋白質20%，脂肪4%，能量3.16kcal/g，由北京科澳協(xié)力公司生產。高脂飼料:碳水化合物30.9%，蛋白質15.8%，脂肪41.2%，能量5.58kcal/g。

1.1.2 喂養(yǎng)方法

SPF級環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度 22±1℃，濕度40%～60%，12h明暗循環(huán)，動物自由攝食和飲水。對照組大鼠喂食普通飼料，建模組大鼠采用普通飼料和高脂飼料混合喂養(yǎng)的方法[3]進行飼喂。

1.1.3 肥胖大鼠建模情況

建模組大鼠經混合喂養(yǎng)20周后，以對照組Lee’s指數(shù)[體重（g）1/3×1000/體長（cm）]的正常值上限 +tv，a·s為肥胖確定標準，大于此標準為肥胖大鼠。

1.2 實驗動物分組

將32只肥胖大鼠隨機分為4組:肥胖對照組、游泳減肥組、限食減肥組和游泳+限食減肥組，每組8只。隨機抽出普通飼料喂養(yǎng)的大鼠8只作為正常對照組。肥胖對照組繼續(xù)混和喂養(yǎng)。游泳減肥組每天上午8點到12點之間，游泳40分鐘，每周游泳6天，持續(xù)5周，游泳水溫28～30℃。限食減肥組計算減肥開始前2周動物平均每日進食量減量1/3，喂養(yǎng)3周后，再減量 1/3，并再持續(xù)2周。游泳+限食減肥組游泳條件與單純游泳減肥組一致，限食條件與限食減肥組一致。正常對照組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)。正常對照組、肥胖對照組和游泳減肥組大鼠自由進食。各組自由飲水。實驗前后稱量各組大鼠體重。

1.3 標本采集和保存

禁食12小時后，將大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，經腹主動脈取血，迅速將血轉入EDTA-K抗凝并添加抑肽酶（aprotinin，25KIU/μl，待測血漿 ghrelin）的離心管，混勻后室溫離心分離血漿（3000r/min，20min），分裝后液氮速凍，然后轉入-80℃凍存。取血后速取出胃組織，沿胃大彎切開，清除內容物，用PBS沖洗干凈，用鋁箔紙包好，迅速投入液氮中速凍，之后轉入-80℃冰箱保存。然后按照同樣的方法取出內臟脂肪并稱重。

1.4 指標測定

血漿ghrelin水平采用美國Phoenix Pharmaceuticals公司的ELISA試劑盒測定。胃組織ghrelin水平采用美國Phoenix Pharmaceuticals公司的RIA試劑盒測定。ghrelin mRNA表達水平采用實時定量RT-PCR方法檢測。RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購自TIAN GEN BIOTECH 公司，SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）購自Takara公司。Ghrelin的引物序列為Forward:5’-GTC TTC AGC GAC TAT CTG C-3’，Re verse:5’-GTG GCT TCT TGG ATT CCT-3’，128bp；內參 18S 序列:Forward:5’-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3’，Reverse:5’-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3’，147bp。預變性 95℃ 30s，PCR 反應 95℃ 10s，60℃30s，40 個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析使用11.5版SPSS統(tǒng)計軟件完成。所有數(shù)據以平均數(shù)±標準差（±s）表示。減肥前后各組體重的比較采用配對樣本t檢驗分析；多組間比較采用One-Way ANOVA的方法；當資料服從雙變量正態(tài)分布時選擇Pearson方法計算相關系數(shù)，當不服從雙變量正態(tài)分布時選擇Spearman方法。顯著性水平為P<0.05，非常顯著性水平為P<0.01。

2 結果

2.1 體重

5周減肥后，與減肥前自身體重相比，各減肥組體重均明顯下降（P<0.05），游泳減肥組、限食減肥組和游泳+限食減肥組分別下降了1.67%、4.41%和5.74%。若綜合考慮肥胖對照組大鼠體重增加的百分比（14.75%），則實際上3個減肥組大鼠的體重則分別相當于減少16.42%、19.16%和 20.49%，見表1。

表1 減肥前后各組大鼠體重比較（n=8）

2.2 內臟脂肪重量

5周減肥后，與肥胖對照組相比，各減肥組大鼠腎周脂肪和睪周脂肪均明顯降低（P<0.01），3個減肥組之間無明顯差異（表2）。

表2 各組大鼠內臟脂肪重量比較（g）（n=8）

2.3 血漿和胃組織ghrelin表達

肥胖對照組大鼠血漿ghrelin水平較正常對照組降低，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與肥胖對照組相比，游泳減肥組和游泳+限食減肥組血漿ghrelin顯著升高（P<0.05），而限食減肥組僅有升高趨勢（P>0.05），具體見圖1A。

肥胖對照組胃組織ghrelin蛋白表達水平較正常對照組顯著降低（P<0.05）。與肥胖對照組相比，游泳減肥組和游泳+限食減肥組胃組織ghrelin顯著增加（P<0.05），但限食減肥組無明顯變化（P>0.05），如圖1B。

肥胖對照組胃組織ghrelin mRNA表達水平較正常對照組顯著降低（P<0.05）。與肥胖對照組相比，各減肥組胃組織ghrelin mRNA表達均明顯增強（P<0.05），見圖1C。

2.4 Ghrelin表達水平與體重、內臟脂肪量之間的關系

機體ghrelin水平與體重和內臟脂肪量都呈負相關關系，即隨著體重和內臟脂肪量增加，ghrelin表達量呈減少的趨勢。其中，胃組織ghrelin mRNA表達與體重和內臟脂肪量之間存在顯著相關關系（P<0.05）。內臟脂肪中的睪周脂肪與ghrelin水平關系較為密切，與胃組織ghrelin蛋白和mRNA表達呈顯著負相關（P<0.05）。其它相關性未見統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 Ghrelin表達與體重、內臟脂肪重量的相關關系（以相關系數(shù)r表示）

3 討論

Ghrelin是由28個氨基酸殘基組成的多肽，是體內促生長激素分泌素受體的內源性配體，它具有強烈的刺激生長激素分泌的作用[4]。此外，ghrelin還可以刺激攝食，促進脂肪合成，減少脂肪動員利用，促進脂肪細胞增殖和分化，進而導致體重增加，其調節(jié)脂肪代謝不依賴生長激素而獨立進行[5]。

研究表明，內源性ghrelin水平會隨著體重的變化而出現(xiàn)波動。我們曾經觀察到，具有肥胖傾向的大鼠（肥胖發(fā)展的早期），胃組織ghrelin呈高表達[6]。動物和人體實驗都發(fā)現(xiàn)，肥胖發(fā)生后，由于體脂能量積累過多，ghrelin合成降低，以減少進食和能量儲備。當肥胖個體體重減輕后，雖然還沒有減到正常體重，下降的ghrelin就已經出現(xiàn)回升[7]。本實驗結果顯示，肥胖大鼠胃組織ghrelin蛋白和基因表達顯著降低（P<0.05），血漿ghrelin呈下降趨勢（P>0.05）；運動、限食及運動+限食減肥后，除了限食減肥組大鼠胃ghrelin蛋白表達未出現(xiàn)增加外，其余胃組織ghrelin mRNA和蛋白表達以及血漿ghrelin濃度均出現(xiàn)明顯增加或增加趨勢（圖1）。

有關運動對血ghrelin水平影響的研究結果多有矛盾。以往研究觀察到一次性或短時間運動可以導致血漿ghrelin 濃度升高[8]、降低[9]或沒有變化[10]。血 ghrelin 的這種變化可能與一次性運動對體重一般產生較小影響有關。長時期運動對血ghrelin的影響也有不同的報道。有研究顯示，正常體重Wistar大鼠進行5周中等強度運動后，體重下降，脂肪組織減少，血漿ghrelin濃度降低[11]。Foster-Schubert等報告，絕經后的肥胖女性，在不限制能量攝入的情況下進行1年適度有氧運動鍛煉，那些最終體重下降的受試者血ghrelin明顯升高，而體重沒有變化者則無明顯變化[12]。這個實驗結果似乎表明，運動本身對血漿ghrelin的持續(xù)濃度沒有影響，只是體重變化才使其發(fā)生改變。本實驗中，肥胖大鼠經過5周的游泳減肥后，體重下降，內臟脂肪含量減少，血漿ghrelin濃度顯著升高，胃組織ghrelin蛋白和基因表達也明顯增強，與Foster-Schubert等的研究結果一致。

通過限食或能量限制減輕體重，也可引起機體ghrelin水平的升高。Beck等[13]發(fā)現(xiàn)肥胖Zuke大鼠限食后，體重下降10%，血漿ghrelin水平明顯升高。Heinonen等[14]的研究也得到了同樣結果:受試者每天攝入800kcal，持續(xù)8周，體重下降≥5%，空腹ghrelin水平明顯升高。讓7～9歲的肥胖兒童限制食物攝入1年，發(fā)現(xiàn)體重指數(shù)（BMI）在前6個月顯著降低，但在接下來的6個月中開始回升。血漿ghrelin濃度在前6個月持續(xù)上升，在6月達到峰值，然后開始下降，在12月時差不多回到初始水平[15]。本實驗中，肥胖大鼠限制食物攝入 5周，體重下降，內臟脂肪含量降低，血漿ghrelin呈升高趨勢，胃組織ghrelin基因表達顯著增強。

運動聯(lián)合限食可明顯引起體重下降，引起血ghrelin升高。Santosa等[16]讓35～60歲肥胖女性減少能量攝入20%，參加運動增加能量消耗10%，導致30%的能量負平衡，6 個月后發(fā)現(xiàn)，體重下降了 11.7±2.5kg（P<0.0001），血ghrelin升高了21.2±26.7%（P<0.001）。北卡羅來納的最近一項研究也表明，肥胖個體限制能量攝入并參加運動鍛煉6個月，體重和脂肪含量都明顯降低，血漿ghrelin水平顯著升高[17]。本研究限制肥胖大鼠食物攝入，并令其進行游泳訓練，5周后，體重和脂肪含量顯著降低，血漿ghrelin、胃組織ghrelin蛋白及基因水平都明顯升高。但也有不同的結果。有人對肥胖兒童青少年的研究發(fā)現(xiàn)，經過10天的限食和運動后，BMI顯著降低，血漿ghrelin有上升趨勢但無統(tǒng)計學意義[18]。Morpurgo 等[19]的研究也顯示，經過3周限食和運動減肥，體重明顯下降，但空腹ghrelin水平無明顯變化。導致血漿ghrelin變化不明顯的原因可能與實驗時間短有關。

目前大部分研究認為，ghrelin與BMI、體重和脂肪含量呈負相關[20]。最近 Sondergaard 等[21]也報告，ghrelin與BMI和總的脂肪含量呈負相關關系，其中內臟脂肪與ghrelin的關系尤為密切。本實驗結果也顯示，ghrelin與體重和內臟脂肪含量呈負相關，其中睪周脂肪與ghrelin的相關程度較高。

胃臟是體內合成分泌ghrelin的主要組織，其產生的ghrelin分泌入血，是血液ghrelin的主要來源。本研究顯示，體重下降引起的血漿ghrelin升高或升高趨勢伴隨著胃組織ghrelin蛋白和mRNA表達的升高或升高趨勢，而后者的升高決定了前者的升高。胃組織ghrelin表達的上調可能與減重時出現(xiàn)的胃排空和饑餓感有關。減肥過程中，體重的減輕伴隨著能量負平衡和饑餓感，這引起ghrelin回升。增高的ghrelin可增強食欲刺激，促進脂肪合成，給繼續(xù)減肥帶來障礙。Ghrelin在減肥中的作用值得注意，機體對減肥的抵抗可能與ghrelin分泌增加有關。遏制ghrelin的升高，可能有助于消除減肥抵抗。

4 總結

飲食誘導的肥胖大鼠血漿和胃組織ghrelin水平下降，經過運動和限食導致體重減輕后，體內ghrelin的表達和分泌水平呈現(xiàn)回升。體內ghrelin水平與體重呈負相關。血漿ghrelin水平回升與胃組織ghrelin表達增高有關。減肥過程中，伴隨著體重下降而出現(xiàn)的ghrelin水平回升，可能是機體減肥抵抗的生理性因素之一。

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