劉林林,劉 念,楊艷明,顧 華,王 欣

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 腫瘤生物治療科,吉林 長春 130041）

過繼免疫治療(Adoptive Cellular Immunotherapy）是通過能直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)的免疫細(xì)胞輸注腫瘤患者體內(nèi)的一種腫瘤治療方法,目前已成為腫瘤治療的一個(gè)全新的領(lǐng)域。其中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine-induced killer,CIK）細(xì)胞是繼淋巴因子激活的殺傷(lymphokine activated killer,LAK）細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltration lymphocyte,TIL）后的新型細(xì)胞,其增殖能力和殺傷活性顯著高于LAK細(xì)胞,是一種安全的輔助治療手段[1]。但臨床觀察中發(fā)現(xiàn)部分患者在接受CIK免疫治療后,療效不理想,認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞對這些免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生了抵抗,這可能與腫瘤患者功能性的DC缺乏有關(guān)。DC作為體內(nèi)功能強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞 ,在細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化過程中發(fā)揮著重要的作用。CIK細(xì)胞和DC聯(lián)合應(yīng)用,不僅可增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性,還可以使效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤靶細(xì)胞的殺傷更具特異性,是目前腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。

消化系統(tǒng)腫瘤病程發(fā)展快,患者就診時(shí)往往已屬中晚期,失去了手術(shù)治療的機(jī)會。為了探討細(xì)胞免疫療法對中晚期消化系統(tǒng)腫瘤的治療效果,本研究選擇27例中晚期消化系統(tǒng)腫瘤患者(男21,女6,中位年齡60歲）,觀察DC聯(lián)合CIK細(xì)胞治療對患者免疫功能的提升作用并評估近期療效,為其在臨床中晚期消化系統(tǒng)腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用提供臨床資料和證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 患者的入選標(biāo)準(zhǔn)本組27例均經(jīng)影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)及理學(xué)等檢查確診為消化系統(tǒng)惡性腫瘤 ,并根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期,所有患者卡式評分達(dá)60分以上,預(yù)計(jì)生存期大于6個(gè)月,無嚴(yán)重的心臟、腎臟及肝臟功能損害(患者一般資料見表1）。

表1 入選患者一般資料

1.2 DC細(xì)胞的制備所有操作均嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP）的程序。應(yīng)用外周血單個(gè)核細(xì)胞采集患者外周血2-3X109個(gè)單個(gè)核細(xì)胞 及血漿80 ml(Kabi Fresenius,German）。經(jīng) Ficoll-Hypaque(Gibco,USA）分離單個(gè)核細(xì)胞后,離心洗滌兩次,用無血清RPM1640(PAA laboratories GmbH,Linz,Austria）重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為2-4×106/ml鋪入6孔板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,孵育兩小時(shí)后,輕晃 6孔板,收集懸浮細(xì)胞至另一個(gè)50 ml離心管,用無血清AIM V(invitrogene）培養(yǎng)液洗板1-2次,加入無血清AIM V(invitrogene）培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);第三天補(bǔ)加DC培養(yǎng)液2-3 ml/孔;第五天加入腫瘤特異性抗原(終濃度為 20-80 μ g/ml）,誘導(dǎo)后 12-16 小時(shí),加入TNF-1(500 U/ml）;第8天收集細(xì)胞,離心,生理鹽水洗滌3次,用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸,總體積為100 ml,經(jīng)靜脈回輸患者,共四次,每次回輸間隔4天。

1.3 CIK細(xì)胞制備將經(jīng)Ficoll-Hypaque(Gibco,USA）分離的單個(gè)核細(xì)胞重懸于無血清AIM V(invitrogene）培養(yǎng)液中,以 2×106/ml鋪入培養(yǎng)瓶,補(bǔ)加INF-(1 000 U/ml）,置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 ;次日補(bǔ)加 CD3單抗(0.5 μ g/ml）及 IL2(1 000 U/ml）,繼續(xù)培養(yǎng);第3天用無血清AIM V(invitrogene）培養(yǎng)液進(jìn)行補(bǔ)液;第11-12天收集CIK細(xì)胞,離心,生理鹽水洗滌3次,用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸,總體積為100 ml,經(jīng)靜脈回輸患者,共四次,回輸時(shí)間選擇在兩次DC回輸之間。

1.4 細(xì)胞的質(zhì)量控制及活性分析

1.4.1 無菌檢測 在每次細(xì)胞回輸前兩天將培養(yǎng)液涂板進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng),在每次細(xì)胞回輸前1小時(shí)通過凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

1.4.2 細(xì)胞的免疫活性分析 分別在第7天及第12天收集DC及CIK細(xì)胞,數(shù)量為2×106,分別用CD3、HLA-DR、CDlα、CD80、CD86 標(biāo)記 DC 細(xì)胞,用 CD3/CD56標(biāo)記CIK細(xì)胞,在4℃避光標(biāo)記30 min,洗滌兩次,重懸于 500 μ lPBS 中,上機(jī)檢測(Calibor BD）。

1.5 回輸前后患者免疫功能分析分別于單個(gè)核細(xì)胞采集當(dāng)天及治療結(jié)束后第7天采集患者外周血,分別用 CD3、CD4、CD8、CD56 進(jìn)行熒光標(biāo)記 ,進(jìn)行T細(xì)胞亞群的檢測。

1.6 毒副反應(yīng)觀察每次免疫細(xì)胞回輸后觀察患者是否出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹等毒副反應(yīng)。

1.7 患者近期療效的評估

1.7.1 患者治療前后生活質(zhì)量改善 應(yīng)用EORTC QLQ-C30生命質(zhì)量測定表及卡氏評分標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)患者生活質(zhì)量改善情況。

1.7.2 按WHO關(guān)于腫瘤近期療效評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn),在患者治療前及治療后1個(gè)月行CT及超聲進(jìn)行對照比較,療效分為完全緩解(CR）,部分緩解(PR）,輕度緩解(MR）,穩(wěn)定(SD）,進(jìn)展(PD）,治療有效率=CR+PR,腫瘤緩解率=CR+PR+MR。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。率的比較均采用 χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增及細(xì)胞表型分析結(jié)果經(jīng)體外擴(kuò)增后CD3+細(xì)胞陽性率由64%提高到95%,CD3+/CD56+細(xì)胞由3%提高到28.7%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,見圖1）。

2.2 治療前后患者免疫功能分析患者治療前免疫功能低下,表現(xiàn)為T輔助細(xì)胞(CD3+/CD4+）百分率低于正常,而T抑制細(xì)胞(CD3+/CD8+）高于正常,造成二者比值降低。治療后患者T輔助細(xì)胞陽性率顯著升高,T抑制細(xì)胞陽性率降低,二者比值回復(fù)正常。同時(shí)患者體內(nèi)NKT細(xì)胞(CD3+/CD56+）也明顯升高。結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）(見表2及圖2）。

圖1 體外培養(yǎng)10天后CIK細(xì)胞表性分析

表2 患者治療前后免疫細(xì)胞表性分析

圖2 患者治療前后免疫細(xì)胞表型對比分析

2.3 毒副反應(yīng)觀察患者經(jīng)DC聯(lián)合CIK細(xì)胞治療后,27例患者中有5例患者出現(xiàn)一過性發(fā)熱反應(yīng)(溫度≤38.5℃）,未經(jīng)過特殊處置在24 h內(nèi)即降至正常。

2.4 患者生活質(zhì)量改善

2.4.1 EORTC QLQ-C30生命質(zhì)量測定表測定結(jié)果

表2 CIK細(xì)胞治療后癥狀緩解情況

2.4.2 27例用Karnofsky評分來評估生存質(zhì)量的改善。治療后卡式評分平均提高10-20分,其中提高19例,穩(wěn)定6例 ,下降2例,提高率為70.4%。

2.5 瘤體變化22例患者經(jīng)DC聯(lián)合CIK細(xì)胞治療后 PR 5例,MR9例,SD 8例,PD 5例,有效率(CR+PR）為51.8%(14/27）,腫瘤控制率(CR+PR+SD）為 81.4%(22/27）。

3 討論

CIK(cytokine induced killer）細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。Schmidt-Wolf[2]等首次報(bào)道了在多種細(xì)胞因子作用下,外周血淋巴細(xì)胞可以被定向誘導(dǎo)成具有殺傷腫瘤活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞,由于該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子,因此具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性自然殺傷細(xì)胞(NK）的非主要組織相容性復(fù)合體(MHC）限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)。體外及動物研究證實(shí)CIK細(xì)胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性小等多種優(yōu)勢[3-4]。目前CIK細(xì)胞已應(yīng)用于部分臨床惡性腫瘤的治療,取得了較好的效果。Kim[5]等將自體CIK細(xì)胞回輸原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)后,提高了機(jī)體的免疫應(yīng)答水平,改善了肝臟功能,患者的癥狀減輕,無不良反應(yīng)。Jiang[6-7]等研究顯示,CIK細(xì)胞聯(lián)合化療治療IV期胃癌的患者,能明顯提高患者的生存質(zhì)量,延長晚期胃癌患者的2年生存期,同時(shí)不良反應(yīng)較小。但在應(yīng)用CIK等免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行過繼免疫治療時(shí),部分患者的治療效果不太理想,這可能與腫瘤患者功能性DC細(xì)胞缺乏有關(guān)。DC作為體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞,能誘導(dǎo)出抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Cytotoxic T lymphocyte,CTL）,在人抗腫瘤免疫的治療中發(fā)揮了重要的作用[8-9]。將CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞聯(lián)合起來治療惡性腫瘤,將有助于解除部分腫瘤患者T細(xì)胞的免疫無能,從而最大程度發(fā)揮其協(xié)同抗腫瘤作用。

CIK細(xì)胞強(qiáng)細(xì)胞毒活性源于其較高的存活率和較強(qiáng)的增殖能力,在本研究中,27例患者的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后10天,CD3+細(xì)胞數(shù)平均增加了35倍;CD3+/CD56+細(xì)胞百分率從3%提高到28.75%,細(xì)胞平均擴(kuò)增了320倍。說明本研究所采用的體外擴(kuò)增技術(shù)能夠滿足對CIK細(xì)胞的高效擴(kuò)增,從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用。惡性腫瘤患者存在T細(xì)胞亞群狀態(tài)異常和比例失調(diào)[10]。在免疫治療前,27例患者中90%以上的患者體內(nèi)存在免疫功能低下,表現(xiàn)為T輔助細(xì)胞(CD3+CD4+）減低或T抑制細(xì)胞(CD3+CD8+）百分率升高,CD4/CD8比值下降,其中肝癌患者免疫功能下降最為明顯。在應(yīng)用DC聯(lián)合CIK細(xì)胞進(jìn)行過繼免疫治療后7天,CD3、CD3+/CD4+陽性細(xì)胞顯著升高,CD3+/CD8+下降,差異有顯著性(P＜0.05）,說明細(xì)胞免疫治療能夠明顯增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能,提高機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)。治療中出現(xiàn)不良反應(yīng)僅為發(fā)熱,發(fā)生率為0.18%,與文獻(xiàn)報(bào)道相似[11]。27例患者中約70%以上的患者在治療后出現(xiàn)體力增加、食欲增強(qiáng)、、睡眠恢復(fù)等生活質(zhì)量改善征象。70.4%患者卡式評分增加10-20分,癥狀的改善與患者免疫功能的提高有關(guān)。在臨床療效方面,治療腫瘤的總有效率為51.8%,腫瘤控制率為81.4%。研究中發(fā)現(xiàn)不同類型的腫瘤療效并不相同,結(jié)直腸癌及胰腺癌的有效率高于肝癌,考慮與肝癌患者存在原發(fā)病毒感染導(dǎo)致免疫功能明顯降低有關(guān)。

在本研究中,我們揭示了DC聯(lián)合CIK細(xì)胞免疫治療能夠提高中晚期消化系統(tǒng)腫瘤患者的免疫功能進(jìn)而發(fā)揮強(qiáng)大抗腫瘤免疫效應(yīng),是一種安全、有效的抗腫瘤治療手段。

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