李富賢 楊亮 米彩峰

（1.陜西省中醫(yī)藥研究院中藥所 陜西西安 710001; 2.陜西省榮譽(yù)軍人康復(fù)醫(yī)院 陜西華陰 714200）

骨傷黃藥散由姜黃,紅花等五味中藥組成,具有活血化淤,消腫止痛作用,用于治療跌打損傷,骨折脫位的早期局部紅腫青紫痛疼。屬多年使用的醫(yī)院制劑,療效顯著,廣受患者歡迎。姜黃,為方中君藥,姜黃素為姜黃主要有效成分,具有抗感染、抗炎、抗凝等作用,與本品功能主治一致;姜黃素的含量測(cè)定方法[1～5]有薄層掃描法、分光光度法、硼顯色分光光度法,熒光分光光度法,高效液相色譜法。前4種方法采用在420nm波長(zhǎng)測(cè)定黃色素的方法,測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定,且受其他黃色素干擾,與其相比HPLC測(cè)定方法簡(jiǎn)單、靈敏、重現(xiàn)性好。故本研究建立以PR-HPLC法測(cè)定姜黃素含量來(lái)控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2010A型高效液相色譜儀,UV-VIS紫外檢測(cè)器,CLASS-VP色譜工作站;超聲波清洗器(型號(hào):KQ-100型昆山市超聲波儀器有限公司)。

1.2 試藥

姜黃素對(duì)照品(供含量測(cè)定用,批號(hào)110823-200603),購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;樣品由本研究所制備(批號(hào)090502,090504,090506);乙腈為色譜純,水為純凈水,其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Akasil-C18(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-4%冰醋酸溶液(48:52)為流動(dòng)相;流速:1.0mL.min-1;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為430nm。

2.2 實(shí)驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約0.3g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱定重量,超聲提取30min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,靜置,微孔濾膜(0.45 μ m)濾過(guò),作為供試品溶液。

圖1 HPPLC圖

表1 姜黃素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取已干燥至恒重的姜黃素對(duì)照品4.55mg置10mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(0.455mg.mL-1)。精密量取該儲(chǔ)備液0.7mL,置10mL的量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成每1mL含0.0318mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例稱取除姜黃外的其它藥材,按制備工藝制成缺姜黃陰性樣品,并按2.2.1項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5μL,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。可見(jiàn)供試品溶液在與對(duì)照品溶液相應(yīng)位置有吸收峰,陰性對(duì)照溶液在姜黃素出峰位置無(wú)干擾,見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

取本品儲(chǔ)備液(0.455mg.mL-1)1mL置10mL的量瓶中加甲醇稀釋至刻度(0.0455mg.mL-1),分別精密吸取該對(duì)照品1、2、3、4、5、6 μL注入高效液色譜儀中,依法測(cè)定,以姜黃素對(duì)照品進(jìn)樣量X(μ g)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程為:Y=7.7869×106X＋2.4 7 4 7×1 0 4,R=0.9999,說(shuō)明在0.0455～0.273 μg范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液(0.03185mg.mL-1)和供試品溶液各5μL,注入HPLC儀中,依法測(cè)定,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定姜黃素峰面積,結(jié)果對(duì)照品RSD=0.80%(n=6),供試品的RSD=0.76%(n=6)。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

供試品溶液在配置后,分別于0、2、4、8、16,24h進(jìn)行測(cè)定。觀察峰面積的變化,結(jié)果表明峰面積在24h之內(nèi)穩(wěn)定,RSD=0.61%。

2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)5份,精密稱定,按供試品溶液的制備方法操作,精密吸取各供試品溶液5μ L,依法測(cè)定,結(jié)果,樣品的RSD=1.73%。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收試驗(yàn),取已知含量的樣品6份,精密稱定,每2份為1組,每組分別加入姜黃素對(duì)照品溶液一定量。按供試品溶液的制備方法操作,并依法測(cè)定姜黃素的含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品(090502,090504,090506),分別按2.2.1項(xiàng)下處理,吸取樣品溶液和對(duì)照品溶液各5μL,注入液相色譜儀,測(cè)定,結(jié)果3批樣品中姜黃素含量分別為2.72mg.g-1,2.62mg.g-1和2.60mg.g-1,平均含量2.65mg.g-1。

3 討論

(1)提取方法選擇參照相關(guān)文獻(xiàn)[4～6]被測(cè)成分姜黃素的理化性質(zhì),擬以甲醇為溶劑提取,對(duì)提取方法(回流法,超聲法)、提取時(shí)間(20、30、40min)進(jìn)行了比較。結(jié)果樣品以甲醇為溶劑,超聲提取30min基本提取完全,并簡(jiǎn)單易行;(2)測(cè)定波長(zhǎng)選擇 姜黃素對(duì)照品溶液用可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果姜黃素最大吸收波長(zhǎng)430nm,故采用430nm作為HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)。在該波長(zhǎng)處測(cè)定不但靈密度高,且避免了雜質(zhì)的干擾。(3)藥典[1]中姜黃素測(cè)定采用C8柱,而一般實(shí)驗(yàn)室常備C18柱,經(jīng)比較2者測(cè)定結(jié)果差異性不大,可互用。

[1]中國(guó)藥典2005版[S].2005:186～456.

[2]王青虎,白玉霞.薄層比色法測(cè)定沙日嘎-4湯中姜黃素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,1998,4(5):12～13.

[3]吳桂碧.薄層掃描法測(cè)定姜黃中姜黃素的含量[J].華西藥學(xué)雜志,1995,10(3):172～174.

[4]趙曉霞,田豐,胥云.RP-HPLC測(cè)定姜黃中姜黃素的含量[J].中國(guó)中藥雜志,2003,28(8):782.

[5]韓剛,張義春,劉士勇.姜黃中黃素素含量測(cè)定方法比較[J].西北藥學(xué)雜志,2005,20(1):15.

[6]陳晉紅,李為榮,劉大為,等.姜黃藥材中有效成分含量測(cè)定[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(3):253.