高傳慶 張鈞利 潘康成

（①山東省濱州市畜牧獸醫(yī)局 256600 ②江蘇無錫阿爾寶爾生物工程有限公司③四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

動物消化道內(nèi)的微生物群落是一個極其復(fù)雜的生物群體，包含有超過400種的細(xì)菌類別，其數(shù)量隨年齡、環(huán)境等條件的變化而產(chǎn)生變化。傳統(tǒng)的微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析是以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過微生物形態(tài)及生理生化特征等表型分析。目前，由于受到培養(yǎng)條件的限制，只能培養(yǎng)與鑒定出約20%～40%的細(xì)菌，對這些存活但不可培養(yǎng)的微生物研究成為制約微生態(tài)學(xué)發(fā)展的瓶頸。另外，傳統(tǒng)的分離計(jì)數(shù)也難以滿足對微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測的需求。分子微生態(tài)學(xué)依據(jù)樣品中微生物核苷酸序列的不同，分析其種類和相對數(shù)量，揭示微生物種類組成以及種群數(shù)量情況，從而對微生物群落結(jié)構(gòu)得到一個比較客觀、全面的認(rèn)識。這種研究方法不受純培養(yǎng)的限制，而且速度快、提供的信息量大，因而特別適合于對消化道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)動態(tài)分析，達(dá)到解析群落結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、實(shí)現(xiàn)對群落功能定向調(diào)控的目的。

1 熒光原位雜交技術(shù)

FISH是根據(jù)16S或23S rRNA上相應(yīng)于特定微生物類群的特異性序列設(shè)計(jì)專一性探針，對樣品進(jìn)行全細(xì)胞熒光原位雜交，利用熒光顯微鏡對所標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)的一種微生物分析技術(shù)，該技術(shù)建立在敏感度極高、不同顏色熒光標(biāo)記基礎(chǔ)上的原位分析法。這種雜交方法的目標(biāo)rRNA主要存在于活細(xì)胞中，因此可以對特定類群的微生物活細(xì)胞進(jìn)行定量描述。目前該技術(shù)多用于環(huán)境中特定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析、特異微生物跟蹤檢測、微生物的空間定位等。Asfie等用該技術(shù)研究金魚排泄物菌群結(jié)構(gòu)的組成，發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬是金魚消化道的主要菌群。Salzman等利用FISH技術(shù)檢測小鼠腸道菌群，結(jié)果有25%的菌群序列為已描述的細(xì)菌，75%為未描述的新細(xì)菌序列，通過設(shè)計(jì)的探針與結(jié)合其它方法可以確定大約80%的大腸內(nèi)細(xì)菌和71%的盲腸細(xì)菌。Kenji等研究大鼠口服乳酸菌后采用FISH檢測鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和植物乳桿菌數(shù)量變化，結(jié)果，口服乳酸菌后的這些細(xì)菌數(shù)量在腸道中得到升高，而給予葡聚糖后的大鼠發(fā)生腹瀉和這些細(xì)菌數(shù)量大量下降。

雖然FISH技術(shù)在環(huán)境樣品中微生物多樣性、污水處理相關(guān)微生物多樣性、內(nèi)共生微生物多樣性以及醫(yī)學(xué)微生物口腔、腸胃、呼吸道菌群多樣性研究中得到了廣泛的應(yīng)用，但該技術(shù)的應(yīng)用要受到環(huán)境樣品微生物生理狀態(tài)的影響，如芽孢、放線菌及休眠時期細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性降低、以及細(xì)菌在繁殖過程中熒光基因可能發(fā)生變化的情況都會影響群落中部分種屬豐度的正確估計(jì)，而且不能檢測出環(huán)境樣品中的未知種屬。再則，F(xiàn)ISH技術(shù)定量的手段還停留在熒光顯微鏡下的人工計(jì)數(shù)階段，這不僅費(fèi)時，而且雜交細(xì)胞的數(shù)量僅限于幾千個，數(shù)量有限，微生物定量的準(zhǔn)確性依賴于樣品的處理和多個視野計(jì)數(shù)的平均，這些因素限制了它的廣泛應(yīng)用。

2 脈沖場凝膠電泳

PFGE的基本原理是利用電泳脈沖系統(tǒng)通過瓊脂糖凝膠分離大片段的DNA，即用限制性內(nèi)切酶將分離物的基因組消解成相對小的大片段后，用脈沖場凝膠電泳將它們分開，從而獲得DNA片段的指紋圖，通過計(jì)算機(jī)凝膠掃描、軟件分析，建立對所有微生物的PFGE圖譜的數(shù)據(jù)庫，以便各菌株間的比較。該技術(shù)可以分離大小為50～1000 kb的DNA片段，甚至可以觀察整個染色體，可用于分離細(xì)菌染色體等大分子DNA。PFGE已經(jīng)成功的應(yīng)用于分析不同細(xì)菌中的染色體構(gòu)成，同時結(jié)合特異性的酶切技術(shù)用于菌種間或同一菌種不同菌株的鑒定。此外，它還可以為判斷基因組的大小和基因圖譜的建立提供有用的資料。PFGE對特異的菌有特征性，步驟簡單，具有高分辨力，且結(jié)果易于分析。Kimura等應(yīng)用此技術(shù)對人糞便樣品檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人的糞便中乳桿菌和雙歧桿菌為主要菌群。O’Riordan等應(yīng)用PFGE結(jié)合限制性酶用于雙歧桿菌種間及菌株間的鑒定，盡管PFGE技術(shù)在菌株間的鑒定具有很大的潛力，但對細(xì)菌菌株的分類鑒別是沒有價值的。該技術(shù)耗時較長，一般需要5d～7d才能完成，這樣大大降低了實(shí)驗(yàn)室分析大量樣品的能力，使其應(yīng)用受到限制。

3 ERIC-PCR技術(shù)

1990年，Sharples等在對E. coli基因組進(jìn)行分析時，首次發(fā)現(xiàn)了ERIC片段，名命為“基因間重復(fù)單位”序列（IRU）。隨后，Hulton等研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌基因間也有這樣的保守重復(fù)序列，并命名為Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)，ERIC的中心有段保守性很高的反向重復(fù)序列，該序列長約44bp。Versalovic等以ERIC的核心序列設(shè)計(jì)一對反向引物，認(rèn)為ERIC-PCR擴(kuò)增是兩個相鄰的ERIC保守序列之間的區(qū)域，由于不同的細(xì)菌基因組上的ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，從而得到一系列大小不同片段組成的DNA指紋圖譜，并將該技術(shù)申報專利。此后，ERIC-PCR技術(shù)被廣泛用于細(xì)菌分類和菌種鑒別上。該方法可直接根據(jù)樣品ERIC條帶的分布、數(shù)量和亮度等信息去分析腸道樣品中菌群結(jié)構(gòu)和種群變化，該法快速、簡潔、不依賴純培養(yǎng)。Di Giovanni等首次報道將ERIC-PCR應(yīng)用到混合菌群群落結(jié)構(gòu)的分析研究上，得到能反映菌群組成差異的重復(fù)性好且穩(wěn)定的指紋圖譜，在研究混合菌體系時，發(fā)現(xiàn)相對于RAPD方法，更穩(wěn)定，重復(fù)性更好，而且具備RAPD不要求模板序列已知而直接進(jìn)行擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)。目前該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于檢測人和動物的腸道菌結(jié)構(gòu)和多樣性。由于ERIC-PCR之后都采用瓊脂糖進(jìn)行電泳分析其條帶，其電泳分辨率較低，在不同系統(tǒng)中有很多條帶具有相同的電泳特性但其序列組成信息不同，可能造成一些腸道菌群的漏檢，Yang等進(jìn)行ERIC-PCR后采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析，可顯著提高其分辨率。

4 PCR-DGGE方法

DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)是利用序列不同的DNA片段解鏈溫度不同的原理，通過梯度變性膠將DNA分離開來的電泳系統(tǒng)。在含有尿素和甲酰胺的濃度線性遞增的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率下降。在雙鏈DNA分子中，AT堿基之間有2個氫鍵，而GC之間有3個氫鍵，因此AT堿基對變性劑的耐受性低于GC堿基對。由于這四種堿基的組成和排列差異，使不同序列的雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度。在電場的作用下，當(dāng)某一雙鏈DNA序列遷移到變性凝膠的一定位置，并達(dá)到其解鏈溫度時，即開始部分解鏈，解鏈程度越大，遷移阻力越大，DNA分子的遷移速度隨之減小，產(chǎn)生的遷移阻力與電場力相平衡時，具有不同序列的DNA片段則停留于凝膠的不同位置，結(jié)束電泳時，形成相互分開的條帶圖譜。

DGGE最早由Fischer和Lerman發(fā)明，并用于檢測DNA突變。Muyzer等首次用于分析土壤環(huán)境的微生物區(qū)系以來，DGGE已成為檢測環(huán)境微生物群落多態(tài)性的一種可靠方法。用DGGE進(jìn)行微生態(tài)研究時，根據(jù)細(xì)菌16Sr RNA基因序列中可變區(qū)的堿基順序，選擇與可變區(qū)（如V3或V6-V8區(qū)）配對的引物，擴(kuò)增出細(xì)菌16S rRNA基因的部分序列，并通過DGGE得到分離，電泳條帶的數(shù)目、位置和強(qiáng)度可辨別出樣品中微生物的種類及細(xì)菌的相對構(gòu)成比例，得出不同樣本的微生物結(jié)構(gòu)及組成。為了使目的序列能夠完全解鏈，在PCR擴(kuò)增目的片段時，在引物的一端人為摻入一段約40個堿基的GC序列用以調(diào)節(jié)目的序列的解鏈行為，可使對核酸片段序列差異的敏感度提高1倍。

PCR-DGGE技術(shù)本身的局限性不容忽視，例如核酸提取的片面性、PCR反應(yīng)過程中形成的16S rDNA嵌合體序列及PCR反應(yīng)中對某些序列的優(yōu)勢擴(kuò)增等。另外，DGGE只能分離較小的DNA片斷(達(dá)500bp)，較長的片斷分離率下降，限制其用于系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息數(shù)量，DGGE只能給出定性的結(jié)果，必須結(jié)合FISH進(jìn)行微生物的確認(rèn)和定量。理論上，只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、電泳時間、電壓等足夠精細(xì)，最少可檢測到只有一個堿基差異的DNA片段，但是DGGE法并不能對樣品中所有的DNA片段進(jìn)行分離，在微生物群落中數(shù)量小于1%的種群不能很好地進(jìn)行分析；此外，不同的DGGE實(shí)驗(yàn)條件很可能導(dǎo)致不同的帶型譜圖，這無疑對序列信息的探針設(shè)計(jì)和系統(tǒng)發(fā)育分析也有一定的影響。盡管DGGE技術(shù)具有以上局限性，但因其重現(xiàn)性強(qiáng)、可靠性高、速度快，可同時檢測多個樣品，能用于對微生物的動態(tài)跟蹤觀察，且可以對特定條帶測序或利用探針雜交方法進(jìn)一步分析，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法分析微生物群落的不足，已逐漸成為現(xiàn)代分子微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域一種重要研究手段，并被廣泛應(yīng)用于檢測動物腸道中的菌群結(jié)構(gòu)和菌群的多樣性。

5 實(shí)時熒光定量PCR

RT-qPCR 是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。RT-qPCR技術(shù)最早由Higuchi提出，當(dāng)時設(shè)想實(shí)時觀察PCR反應(yīng)的全過程，最終達(dá)到檢測樣品中的DNA量的目的。1995年美國PE公司成功研發(fā)了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺Real-time PCR檢測系統(tǒng)，使該技術(shù)得以應(yīng)用和推廣。RT-qPCR的化學(xué)原理包括熒光探針類和熒光嵌合類兩種。熒光探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，如Taqman探針、復(fù)合探針、分子信標(biāo)、雙雜交探針等，其中以前兩者最為常用。TaqMan探針法中所用TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。探針的5'末端連接報告熒光基團(tuán)FAM（6-羧基熒光素），而3'末端則連接淬滅熒光基團(tuán)TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，兩基團(tuán)之間構(gòu)成共振結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。但在進(jìn)行PCR延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，破壞了兩基團(tuán)間的共振結(jié)構(gòu)，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號得以釋放，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接受到熒光信號。DNA模板每復(fù)制一次，就有一個探針被水解，并釋放出熒光信號，理論上被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目與PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系，光密度同釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目成正比關(guān)系，因此對模板達(dá)到了準(zhǔn)確定量。目前，RT-qPCR的Taqman探針技術(shù)被認(rèn)為是腸道菌定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

該技術(shù)是對常規(guī)PCR技術(shù)的革新，其定量和擴(kuò)增同步進(jìn)行克服了PCR的平臺效應(yīng)；除加樣開蓋外，其后完全是閉管操作，減少污染；不需PCR后處理，避免假陽性；可直接監(jiān)測擴(kuò)增中熒光信號變化獲得定量結(jié)果，精確性和靈敏度高；檢測速度快，幾個反應(yīng)可同時進(jìn)行，多色熒光檢測；特異性和重復(fù)性強(qiáng)；應(yīng)用范圍廣。經(jīng)典的腸道菌群檢測方法只是檢測可培養(yǎng)的優(yōu)勢菌群，而RT-qPCR技術(shù)，還可以檢測不可培養(yǎng)的菌群，并且可以通過進(jìn)一步的定量分析來確定在具體腸道某一類有益菌和有害菌在腸道的定植規(guī)律，以及更深入研究它們對動物健康狀況的影響。RT-qPCR技術(shù)能直接采用從糞便樣品中提取的細(xì)菌DNA來定量腸道中的優(yōu)勢菌群和非優(yōu)勢菌群。因此，近年來，以16S rDNA基因?yàn)榛A(chǔ)的RTPCR已被成功用于腸道菌群結(jié)構(gòu)及細(xì)菌定量、病源檢測、基因表達(dá)分析等多個領(lǐng)域的研究，并日益顯出了它的優(yōu)越性。

6 結(jié)束語

上述幾種分子生物學(xué)方法已經(jīng)建立了比較成熟的技術(shù)，每一類方法都有自身的功能和局限性，也都在發(fā)展和完善當(dāng)中，并相互補(bǔ)充相互推動。傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法積累了種群分類的大量數(shù)據(jù)，為生物標(biāo)記方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)提供了良好的背景材料，在功能特性的認(rèn)識上有獨(dú)特的優(yōu)勢。生物標(biāo)記方法可快速進(jìn)行單個環(huán)境微生物樣品的群落結(jié)構(gòu)和多樣性解析，但在定性上依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法?，F(xiàn)代分子生物學(xué)提高了解析的靈敏度，在基因水平上擴(kuò)大了物種多樣性的視野，其中基因指紋技術(shù)可同時分析多個樣品，直觀顯示了種群結(jié)構(gòu)變化情況，有助于分析調(diào)控因子對群落結(jié)構(gòu)和群落功能的影響。 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使微生物多樣性研究更直接，也給腸道微生物研究展示了一個革命性的前景。每種方法有各自的應(yīng)用特點(diǎn)，在腸道微生態(tài)的研究中，應(yīng)該根據(jù)不同的研究對象，采取不同的分子生物學(xué)方法或聯(lián)合應(yīng)用幾種方法才可能對腸道菌群有一個更全面的了解。