惠子健

(山西醫(yī)科大學,山西 太原 030001)

20世紀 30年代 Muller發(fā)現(xiàn)了保持染色體穩(wěn)定的端粒結(jié)構(gòu),1985年 Greider和 Blackburn在四膜蟲細胞提取物中發(fā)現(xiàn)了端粒酶,并證實端粒酶具有維持端粒長度的功能。1989年 Morin等人在宮頸癌的Hela細胞發(fā)現(xiàn)活化的人端粒酶,從此對端粒酶的研究便不斷深入,本文對端粒酶的研究進展綜述如下。

1 端粒酶的結(jié)構(gòu)

端粒酶(Telomerase)又稱端粒末端轉(zhuǎn)移酶。目前認為人端粒酶結(jié)構(gòu)上主要包括三種成分:端粒 RNA成分((human telomerase RNA component,hTR)、端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcip tase,hTERT)和端粒酶相關(guān)蛋白(TEP/TLP1/TP1)。在體外,僅有 hTR與 hTERT兩種成分就能表達出完整端粒酶的活性。

1.1 hTR

端粒酶的 RNA亞基(hTR)是合成端粒 DNA的模板,實驗證明它對端粒酶的結(jié)構(gòu)和催化活性都很重要[1～3]。人端粒酶RNA于 1995年被克隆成功,基因位于 3p 26.3[4],長度 445個核苷酸,為單拷貝基因,由 RNA聚合酶Ⅱ進行轉(zhuǎn)錄,hTR模板序列為 5'-CUAACCCUAAC-3'[2],模板區(qū)序列與人端粒DNA序列互補。以端粒 3'-末端為引物,在端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化下,通過模板的滾動,特異合成端粒DNA,延長端粒。端粒酶RNA的序列和長度都有保守的二級結(jié)構(gòu),從 5'到 3'方向包含四個保守的雙螺旋,雙螺旋Ⅰ是最保守的區(qū)域,雙螺旋ⅡⅢ是莖環(huán)結(jié)構(gòu),這些保守的莖環(huán)通常是蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域,對保持端粒酶的功能十分重要[3]。Autexier[5]用小核核酸酶處理部分純化的人 293細胞所構(gòu)成的重組體系確定 hTR最小功能區(qū)位于44 nt～203nt,其中在 170 nt～179 nt,180 nt～189nt,190nt～199 nt間的突變均可使 hTR完全失活,提示這3個核苷酸區(qū)域?qū)TR活性是必須的,可能與端粒酶蛋白組分結(jié)合有關(guān)。

1.2 hTERT

端粒酶催化亞單位hTERT是具有反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)的組分[6]。1997年,Nakamura等克隆了人類端粒酶蛋白TP1(telomerase associated protein1)和 TP2(telomerase associated protein2)。其中TP1能與端粒酶RNA特異性結(jié)合,命名為端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。hTERT定位于5pl5.33,為單拷貝基因,其 cDNA也已被克隆。長度約為40 kb,可讀框的翻譯產(chǎn)物 hTERT分子量為127 kD,屬于逆轉(zhuǎn)錄酶超家族的亞群[7]。hTERT的表達與端粒酶活性呈正向相關(guān),端粒酶活性主要由 hTERT表達水平的高低決定[8～9]。因而認為hTERT基因轉(zhuǎn)錄水平是調(diào)節(jié)端粒酶活性的重要限速步驟之一[10]。目前研究證明hTERT為人端粒酶的催化亞基。

1.3 端粒酶相關(guān)蛋白

人類端粒酶相關(guān)蛋白于 1997年被克隆成功[11]。研究發(fā)現(xiàn),人端粒酶相關(guān)蛋白能夠協(xié)同端粒酶全酶的組裝,與端粒酶體內(nèi)活性有關(guān),在端粒酶的活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,因此,也被稱為端粒酶的調(diào)節(jié)亞基。但其在體內(nèi)對端粒酶活性和端粒長度保持并不是必需的。

2 端粒酶的生物學特性

在大多數(shù)人體正常組織或者細胞中,并不表達端粒酶活性,但少數(shù)有增殖潛能的細胞,如造血干細胞、生殖細胞、皮膚細胞、免疫記憶細胞等有增殖潛能的細胞有低水平端粒酶表達。端粒酶能夠以自身的RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄合成端粒 DNA重復序列并添加到端粒末端,以維持端粒長度,保持染色體的相對恒定[8]。端粒酶對端粒的延伸是精確調(diào)控的過程,是各個亞單位相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。首先,端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶被激活,進而催化激活端粒酶;而后,端粒酶通過結(jié)合蛋白結(jié)合在 DNA的TG引物及端粒酶 RNA模板上,使端粒引物末端位于端粒酶 RNA模板區(qū)的起始端,然后開始合成端粒 DNA,進行到模板區(qū)的末端時,延長的 DNA末端與RNA模板配對解開,但脫落的端粒仍然結(jié)合在端粒酶結(jié)合蛋白上,其末端又結(jié)合在端粒酶 RNA模板區(qū)的起始位,如此反復合成端粒,直到端粒達到一定長度后終止。

端粒酶不只是專一地合成端粒重復序列,已有一些實驗證實其具有其他功能如抗細胞凋亡、DNA修復等。

在不同的細胞系中端粒酶都有抗凋亡的作用[12]。在腫瘤細胞中,抑制端粒酶的活性能誘導腫瘤的凋亡,而且凋亡的出現(xiàn)要遠遠早于端粒的明顯縮短[13]。正常的成纖維細胞表達端粒酶就能使細胞對凋亡和壞死更有抵抗力[14]。提示端粒酶在細胞抗凋亡過程中有很重要的作用。

端粒酶在DNA修復或抑制DNA破壞的過程中也起重要作用。在神經(jīng)細胞中,表達 hTERT能保護細胞免受 DNA破壞因素引起的凋亡[15],Shnana.GG[16]等人的實驗顯示,外源性hTERT轉(zhuǎn)入不僅能夠使一些 DNA修復基因轉(zhuǎn)錄活性增高,而且能夠通過提高dNTP的水平來維持染色體穩(wěn)定、提高DNA修復功能。

3 端粒酶活性的調(diào)節(jié)

由于端粒酶能夠調(diào)節(jié)端粒長度以及抗細胞調(diào)亡、DNA修復等的特殊功能,因此基于端粒酶活性調(diào)節(jié)的研究成為焦點,分為誘導端粒酶活性與抑制端粒酶活性兩個方向。

3.1 誘導端粒酶活性

組織細胞工程學中,定向誘導干細胞分化為各種組織細胞以及體外支架誘導細胞塑造人工器官研究越來越深入。因此增加端粒酶的活性,維持細胞分化和增殖能力,延長細胞的壽命抑制細胞衰老具有重要意義。目前的研究方法是將攜帶hTERT基因的載體轉(zhuǎn)染干細胞,激活端粒酶,使被轉(zhuǎn)染的干細胞端粒酶活性升高。Sarin等[17]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠上皮組織表達TERT時,可以使毛發(fā)終止期的毛囊干細胞轉(zhuǎn)化為活躍期,小鼠長出了新長的毛發(fā)。Simonsen等[18]將外源性端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細胞,誘導向成骨細胞分化,轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細胞端粒酶活性增高,260個群體倍增水平后細胞還能繼續(xù)分裂,核型正常不致瘤,表達成骨細胞標志,使細胞活力大大增強。Bodnar AG等[19]將編碼了人類端粒酶催化亞基的載體轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜色素上皮細胞和包皮成纖維細胞中,這兩種細胞在正常人細胞中端粒酶表達呈陰性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)端粒酶表達呈陰性的細胞的端?？s短、細胞衰老,而端粒酶表達呈陽性的細胞的端粒伸長,細胞分裂旺盛。這些端粒酶陽性細胞的壽命超出正常細胞的壽命 40倍,核形正常。

3.2 抑制端粒酶活性

研究發(fā)現(xiàn)80%以上的腫瘤組織端粒酶活化,雖然不是腫瘤發(fā)生的早期因素,但腫瘤中端粒酶的活化是腫瘤發(fā)生的一個重要步驟,而且與腫瘤的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和周期等相關(guān)。而正常組織中(包括正常干細胞)端粒酶的表達水平較低或只是暫時性表達,且與腫瘤細胞相比端粒較長,因此基于抑制端粒酶活性的癌癥治療藥物成為可能。目前的研究方向主要集中在酶直接抑制劑、端粒酶主動免疫治療,以及干擾端粒酶反轉(zhuǎn)錄過程等幾個方面。已有大量綜述和論文報告端粒酶抑制劑的研究現(xiàn)狀,本文不再一一介紹。

有效和特異的小分子抑制劑至今尚未能找到[20]。端粒酶作為癌癥靶標仍然處于臨床早期階段。人們還未能完全了解端粒酶的作用和其在正常生物學和癌癥病理生理學中的端粒動力學,近期研究人員在部分腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了端粒延長的旁路途徑,使面臨的問題更加復雜化,目前臨床試驗中的藥物可能并不能通過最終驗證,無疑面臨著諸多挑戰(zhàn)與機遇。

4 問題與展望

綜上所述,目前對端粒酶的了解尚不充分,現(xiàn)有研究在闡明端粒酶的作用機理方面雖然取得了不少進展[21～22],但在分子水平上對端粒酶的具體調(diào)控機制仍不明了,端粒酶活性變化的規(guī)律還有待揭示。因此研究仍處在起步階段,對端粒酶活性的調(diào)節(jié)還無法做到時間和活性的精確控制。但隨著研究的深入,端粒酶的秘密將逐漸被揭開。將對人類延緩衰老,治療疾病開辟出新的途徑。

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