王忠太，馬佳玲

（甘肅省康復中心醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞及鑒定

王忠太，馬佳玲

（甘肅省康復中心醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 建立大鼠胸主動脈平滑肌細胞的組織塊貼壁法。方法 采用組織塊貼壁法進行原代培養(yǎng)，胰酶消化法傳代，并應(yīng)用相差顯微鏡和平滑肌肌動蛋白對細胞進行形態(tài)學和免疫組化鑒定。結(jié)果 90%的組織塊接種存活，培養(yǎng)5代的平滑肌細胞純度達98%以上。鏡下可見培養(yǎng)細胞呈典型的“峰-谷”狀生長，免疫組化染色顯示胞漿內(nèi)平滑肌肌動蛋白陽性表達。結(jié)論 組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠平滑肌細胞操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、純度較高、存活率高。

平滑肌細胞；組織塊貼壁法；原代培養(yǎng)

血管平滑肌細胞（VSMC）的異常增殖、遷移、凋亡不足及細胞外基質(zhì)沉積造成的內(nèi)膜增生是動脈粥樣硬化、冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄、移植血管病變的主要原因。動脈平滑肌細胞培養(yǎng)是進行平滑肌細胞分子生物學研究的基本條件，可用于多種與平滑肌細胞生長、增殖有關(guān)的疾病發(fā)病機理及藥物作用機制的研究，如動脈粥樣硬化、經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA）術(shù)后再狹窄、藥物的鈣通道開放（拮抗）作用、血管損傷引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡等。本研究在參照國內(nèi)外經(jīng)驗[1～3]的基礎(chǔ)上，建立了一種簡便、易行的原代培養(yǎng)大鼠VSMC方法。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠體重120～150g，雌雄不限，購自蘭州大學GLP實驗動物中心。DMEM（高糖型）培養(yǎng)基、胰蛋白酶粉、標準胎牛血清均購自HyClone公司。小鼠抗大鼠SM-actin單克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司（中國）。青霉素鈉、硫酸鏈霉素（華北制藥廠），24孔板，10mm×10mm蓋玻片，25cm2塑料培養(yǎng)瓶（Costar公司）及手術(shù)器材。

1.2 細胞培養(yǎng)

1.2.1 原代培養(yǎng) SD大鼠斷頸處死，放血，75%乙醇浸泡5min，移入超凈工作臺內(nèi)，沿腹中線剖開胸腔、腹腔，剪開膈肌，翻開左側(cè)肺葉，可見在脊柱前走行的胸主動脈。小心分離取出胸主動脈，立即置于含青霉素100U/ml，濃度100mg/ml硫酸鏈霉素的無菌PBS液體中。用兩把眼科鑷輕輕夾住血管向相反方向稍用力牽拉，呈袖套樣剝除外膜。更換平皿，用PBS液漂洗2次后，縱向剖開血管，將血管內(nèi)膜面朝上平鋪于培養(yǎng)皿上，用眼科彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜，以去除內(nèi)皮細胞。用眼科彎剪反復將其剪成1mm×1mm的組織塊，邊緣整齊、光滑，用彎頭吸管移入并均勻貼放于25cm2培養(yǎng)瓶底面，間隔約5mm，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向瓶內(nèi)加入約4ml含體積分數(shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基。然后瓶蓋旋松，于CO2培養(yǎng)箱中靜置4～6h，使組織塊干涸并與瓶底貼壁附著后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置于37℃的CO2孵箱中3～7d。待有細胞從組織塊周圍游出后換液，以后約2～3d換液1次。

1.2.2 細胞換液 細胞換液主要根據(jù)細胞生長狀況及培養(yǎng)液的顏色變化決定。當細胞增殖旺盛，培養(yǎng)液由桃紅色變?yōu)辄S色時，需換液。在超凈工作臺上，吸棄原培養(yǎng)基，用PBS液輕輕沖洗后，加入新鮮的含體積分數(shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，也可進行半量或2/3量換液。換液時應(yīng)動作輕柔，盡量不要碰到組織塊。

1.2.3 細胞傳代 至單層細胞鋪滿近培養(yǎng)瓶底的80%以上時即可進行傳代。將原代細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)液小心吸棄，加入PBS液2ml輕晃培養(yǎng)瓶沖洗細胞，吸棄，加0.25%（g/L）胰酶液2ml在37℃消化約40s。倒置顯微鏡下見細胞回縮、變圓，細胞成片收縮呈球形時，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打瓶壁細胞使其完全脫落，形成的細胞懸液按1∶2或1∶3接種。周期約為5～7d。首次傳代時，脫落的組織塊可以轉(zhuǎn)移到新的25cm2培養(yǎng)瓶中，按原代培養(yǎng)方法使組織塊重新貼壁。24h后可見細胞重新貼壁生長。以后約2～3d換液1次，1周左右后細胞再次長成致密單層時即可再次傳代。待細胞傳代至3～5代，即可用于實驗。

1.2.4 細胞凍存、復蘇 凍存時取對數(shù)生長期細胞，凍存前一天最好換液。消化細胞將其收集于離心管，計數(shù)、離心后棄上清液，加凍存液（DMSO、血清、DMEM 培養(yǎng)基以 1∶3∶6 配制），使細胞的最終密度為（5～10）×106/ml，分裝入凍存管中，置4℃冰箱冷卻1h后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱冷卻2h，最后保存在-70℃冰箱中。復蘇時從-70℃冰箱中取出凍存管，直接投入37℃水浴箱中，使其盡快融化。用吸管吸出細胞懸液，注入離心管加含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，離心后棄上清液。培養(yǎng)液適當稀釋后接種于培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2．1 平滑肌細胞培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

原代培養(yǎng)第4～7d，可見少量細胞自組織塊邊緣游出，但不是所有的組織塊周邊都有，漸向外生長形成細胞暈，進而形成細胞簇，且形態(tài)多樣（梭形、多角形、星形或不規(guī)則形），大小略有差異。此后細胞呈放射性生長，至第10d，隨著細胞的增殖，培養(yǎng)瓶內(nèi)可見大量細胞平行生長鋪滿瓶底。部分區(qū)域細胞多層重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰-谷”狀生長。傳代后80%～90%的細胞可重新貼壁生長，其生長方式及形態(tài)特點同前。

2.2 VSMC組織學鑒定

培養(yǎng)第5代的細胞經(jīng)特異的SMα-actin免疫細胞化學染色后，胞漿著棕黃色，呈陽性表達。此免疫組化結(jié)果表明，所得細胞確為典型的VSMC。

3 討論

VSMC的增殖是介入術(shù)后再狹窄發(fā)生和動脈硬化（AS）過程中的一個關(guān)鍵因素。在動脈粥樣硬化病變的發(fā)展和血管損傷的反應(yīng)中，VSMC遷移至血管壁內(nèi)膜下，離開靜止期G0/G1，進入細胞周期促進病變的反應(yīng)[4]。因此，研究防治VSMC增殖成為血管生物學領(lǐng)域的熱點。體外VSMC為尋找新的防治方法提供了實驗模型。

研究表明，平滑肌細胞是動脈中膜唯一類型的細胞，因此主動脈中膜可作為獲取平滑肌細胞的最佳來源。目前，常用的方法有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法雖然培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量高，但膠原酶價格昂貴，且試驗中污染機會大，最佳消化時間不好把握，消化酶本身對細胞有毒性作用，易消化過度導致細胞活力不佳。組織塊貼壁法具有獲得平滑肌細胞純度高、量多，操作簡單的優(yōu)點，可避免酶消化法的上述弊端。

在培養(yǎng)過程中，應(yīng)注意以下幾點：（1）選擇血管供體時，一般選用120～150g的大鼠。體重太小，血管細，操作困難；體重太大則細胞活力弱，不易生長。（2）取下胸主動脈至將組織塊種植到培養(yǎng)瓶時間最好不要超過半小時；嚴格無菌操作，減少污染機會。（3）剝除血管外膜和內(nèi)膜時，動作輕柔，避免用力牽扯，使細胞受傷，活力下降。（4）分離中膜時，要徹底剝離內(nèi)膜與外膜，以減少內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的污染。（5）組織塊大小以1mm3較為合適，邊緣整齊、光滑，以利于細胞游出。注意細胞密度，一般取2～3只大鼠的胸主動脈組織塊均勻接種于25ml培養(yǎng)瓶中，間隙約2～3mm，以保證細胞游出后有足夠的生長空間并保持細胞密度的均勻。（6）組織塊干涸貼壁后及時翻正培養(yǎng)瓶，時間約為1.5～3h。干涸時間短有利于細胞存活，但不利于貼壁。（7）及時清理漂起的組織塊。可將漂起的組織塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中重新貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)。（8）營養(yǎng)液中血清質(zhì)量是關(guān)系到培養(yǎng)能否成功的重要因素，最好使用優(yōu)質(zhì)的胎牛血清，原代培養(yǎng)時可將血清濃度提高到25%，消化傳代后營養(yǎng)液中血清濃度為15%。（9）一般3～5d換液1次，換液時不可將瓶內(nèi)原培養(yǎng)液全部換掉，應(yīng)保留1/3原培養(yǎng)液，然后加入新鮮培養(yǎng)液至原量。這樣可使細胞保持相對穩(wěn)定的體液環(huán)境，又不致缺乏營養(yǎng)，有利于細胞保持正常的生長速度。

[1]Wang Z，Rao P J，Castresana M R，et al.A method to isolate morphologically distinct clones of smooth muscle cells from human saphenous vein[J].Methods in Cell Science，2002，24:131～137.

[2]Lemire J M，Covin C W，White S，et al.Characterization of cloned aortic smooth muscle cells from young rats[J].Am J Pathol，1994，144:1068～1081.

[3]梁若斯，陳德.成人動脈平滑肌細胞體外培養(yǎng)模型的建立[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2002，12（10）:31.

[4]Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s[J].Narue，1993，362:801～809.

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1671-1246（2010）03-0097-02