馬信龍，孫曉雷，馬劍雄，王志鋼，張華峰

富血小板血漿聯(lián)合鈣化誘導對骨髓間充質干細胞增殖和成骨活性的影響

馬信龍1，2，孫曉雷2，馬劍雄1，王志鋼1，張華峰1

目的:觀察富血小板血漿與地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉聯(lián)合應用對體外培養(yǎng)的MSCs增殖和誘導成骨的影響。方法:應用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法從兔髂骨骨髓中分離、純化骨髓間充質干細胞（MSCs），取第3代MSCs隨機分為3組，空白對照組加入含10%血清DMEM培養(yǎng)基，鈣化誘導組利用含有鈣化誘導劑0.1 μmol/L的地塞米松、50 mg/L的維生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的DMEM培養(yǎng)基，聯(lián)合誘導組加入含有1%PRP及鈣化誘導劑的DMEM培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)8 d。結果:MSCs傳至第3代細胞多呈長梭多角形。誘導培養(yǎng)5 d后，空白對照組堿性磷酸酶染色弱陽性，鈣化誘導組堿性磷酸酶染色為陽性，聯(lián)合誘導組堿性磷酸酶染色為強陽性。誘導培養(yǎng)21 d，兩誘導組鈣結節(jié)茜素紅染色均呈陽性，MTT法顯示誘導培養(yǎng)第2～5 d聯(lián)合誘導組細胞增殖明顯高于鈣化誘導組(P＜0.05)。堿性磷酸酶定量測定顯示，聯(lián)合誘導組于第3 d、5 d和7 d，OD值均高于鈣化誘導組(P＜0.05)。結論:富血小板血漿（PRP）與地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉聯(lián)合應用于MSCs的成骨誘導，優(yōu)于單純鈣化誘導方法，且誘導的成骨細胞具有更好的增殖及成骨活性。

富血小板血漿；骨髓間充質干細胞；誘導成骨

近年對自體富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)在骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,MSCs)誘導成骨中的作用逐漸受到重視，但對于各誘導方法所誘導的成骨細胞增殖及分化能力報道不一。如何改善誘導方法來促進MSCs增殖，并提高誘導成骨細胞的分化能力，是一個值得深入研究的問題。本實驗旨在觀察一種聯(lián)合誘導的方法對MSCs增殖及誘導成骨細胞分化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、胰蛋白酶（中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所）；地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉（sigma公司）；堿性磷酸酶染色試劑盒、堿性磷酸酶定量檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；噻唑藍、對硝基苯磷酸二鈉鹽、二甲基亞砜、茜素紅(天津市光復精細化工研究所)；培養(yǎng)瓶、96孔板(Corning，美國)；超凈工作臺（SW-CJ-1F型，蘇州）倒置相差顯微鏡（COIC，重慶）；CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，酶標測試儀(safire-2，北京)；恒溫離心機(Heraeus，德國)。721分光光度計（上海）。

1.2 實驗動物 健康雄性新西蘭大白兔1只（3月齡，2.5 kg，中國醫(yī)學科學院放射研究所）,實驗動物級別為清潔級,實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。許可證號：SCXK（冀）2003-1-003）。

1.3 方法

1.3.1 MSCs的分離和培養(yǎng)[1]將大白兔使用20%烏拉坦肌肉注射麻醉下，16號骨髓穿刺針抽取髂骨骨髓5 mL，肝素抗凝，與等體積的PBS混勻，按1∶1的比例緩慢加入Percoll分離液（密度為1.073 g/mL）中。以1 500 r/min離心10 min，小心吸取交界處的白膜層上下約5 mL，加入等量PBS重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，共2次。離心后棄上清加入L-DMEM培養(yǎng)液（含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）重懸細胞，接種于50 mL培養(yǎng)瓶內，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。第3 d首次換液，以后隔天換液，當細胞融合80%后，胰蛋白酶消化按1∶2傳代細胞至第3代備用。

1.3.2 富血小板血漿的制備 嚴格無菌的條件下，用裝有0.5 mL、10%枸櫞酸鈉的10 mL注射器，從兔耳中央靜脈抽取6 mL血，采用landesberg法[2]，第1次1 500 r/min離心10 min，吸取全部上清液至交界面下約3 mm，于另一離心管2 000 r/min二次離心10 min，此時分為2層。棄掉大部分上清液，余即為PRP約1 mL,將1 mL PRP加入98 mL DMEM液中，同時加入1 mL含l 000 U凝血酶的l0%CaCl2溶液，攪拌5 min，0.2濾膜過濾，即為1%PRP條件培養(yǎng)基，-20℃冰箱凍存[3]。

1.3.3 MSCs的分組誘導 取第3代MSCs按2.0× 104每孔接種于7個12孔板內，先以L-DMEM培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）培養(yǎng)1 d使各組同步化，棄去培養(yǎng)液PBS清洗兩次。隨機將每塊12孔板分成2組，每組6孔。鈣化誘導組加入含有鈣化誘導劑0.1 μmol/L的地塞米松、50 mg/L的維生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的DMEM培養(yǎng)基，聯(lián)合誘導組加入含有1%PRP及鈣化誘導劑的DMEM培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)8 d，空白對照組加入含10%血清DMEM培養(yǎng)基。于第3、5、7 d每天取兩組進行ALP定量測定。

1.3.4 MSCs誘導成骨細胞的鑒定 取第3代MSCs以1×104個/mL接種于4個50 mL培養(yǎng)瓶，瓶底放置無菌蓋玻片，分別加入含鈣化誘導液和聯(lián)合誘導液的DMEM液。設空白對照組加入常規(guī)DMEM培養(yǎng)液（含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素），隔天換液培養(yǎng)7 d后取出蓋玻片，PBS沖洗2遍，95%酒精固定10 min，以ALP試劑盒使用說明進行堿性磷酸酶組織化學染色。同上誘導培養(yǎng)18 d，進行鈣結節(jié)茜素紅染色。

1.3.5 細胞增殖測定（MTT法） 取第3代MSCs以2×104/mL細胞接種于96孔板，每孔體積200 μL，常規(guī)DMEM培養(yǎng)24 h使各孔細胞同步化后，隨機按聯(lián)合誘導組加入聯(lián)合誘導DMEM培養(yǎng)液，鈣化誘導組加入鈣化誘導DMEM培養(yǎng)液，空白對照組加入含10%血清DMEM培養(yǎng)基，隔天換液。每天3組各取10孔進行增殖測定，共7 d。測定前4 h，PBS沖洗后換無血清DMEM 100 μL，加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min，充分溶解后，于酶標儀上測定492 nm波長吸光度OD值。

1.3.6 堿性磷酸酶定量測定 取第3代MSCs以5× 104/mL細胞接種于24孔板，每孔為1 mL，24 h后棄培養(yǎng)液和未貼壁細胞，PBS洗2次，隨機分組，每組24孔。以聯(lián)合誘導組加入聯(lián)合誘導DMEM培養(yǎng)液，鈣化誘導組加入鈣化誘導DMEM培養(yǎng)液。分別于第1、3、5、7 d兩組各取6孔，棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入0.2%TritonX-100裂解液1 mL，震蕩10 min，按堿性磷酸酶試劑盒（磷酸苯二鈉法）說明進行操作，于分光光度計測定520 nm波長吸光度A值，計算ALP活性。

2 結果

2.1 MSCs形態(tài)學觀察 細胞接種3 d后第1次換液棄去大部分不貼壁造血系細胞，可見少數(shù)圓形單核細胞貼壁，7 d后細胞開始增殖并向多種細胞形態(tài)分化，逐漸形成分散的細胞集落。約10 d后細胞集落相互融合成單層，傳至第1代后細胞形態(tài)多為星形、多角形，細胞胞體較前為大且增殖加快，見圖1。

2.2 細胞增殖測定結果 聯(lián)合實驗組與鈣化對照組測定的OD值見表1,誘導培養(yǎng)第2～5 d聯(lián)合誘導組細胞增殖均高于鈣化誘導組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且聯(lián)合誘導組于第4 d進入平臺期，早于鈣化誘導組。

2.3 堿性磷酸酶鈣鈷染色 兩誘導組堿性磷酸酶染色均呈強陽性，胞質內可見灰黑色沉著，見圖2。倒置顯微鏡觀察兩組無明顯差異，空白對照組誘導培養(yǎng)5 d后ALP染色弱陽性，胞質內見少量黑色沉著，見圖3。

2.4 鈣結節(jié)茜素紅染色 兩組誘導培養(yǎng)18 d后，倒置顯微鏡觀察可見白色鈣結節(jié)生成，兩組無明顯差異，空白對照組未見鈣結節(jié)形成。經(jīng)茜素紅染色后，空白對照組染色為弱陰性．兩誘導組均呈強陽性反應，見圖4。

表1 鈣化組與聯(lián)合組骨髓基質干細胞的增殖情況OD值)

表1 鈣化組與聯(lián)合組骨髓基質干細胞的增殖情況OD值)

注：與鈣化組比較，*P＜0.05；與對照組比，﹟P＜0.05

組別鈣化組聯(lián)合組對照組1 d 0.09±0.07 0.10±0.13 0.08±0.08 2 d 0.18±0.09 0.23±0.30*﹟0.09±0.04培養(yǎng)時間(d) 3 d 0.20±0.17 0.58±0.20*﹟0.16±0.07 4 d 0.67±0.19 0.90±0.97*﹟0.57±0.14 5 d 0.87±0.07 1.01±0.03*﹟0.77±0.02 6 d 1.08±0.11 1.03±0.17 0.90±0.03

圖1 第3代MSCs多呈多角形生長（HE×40）

圖2 聯(lián)合誘導培養(yǎng)5 d后ALP染色強陽性，胞質內見大量黑色沉著(×100)

圖3 鈣化誘導組誘導培養(yǎng)5 d后ALP染色陽性，胞質內見少量黑色沉著(×100)

圖4 聯(lián)合誘導培養(yǎng)18 d后鈣結節(jié)染色陽性(×40)

2.5 堿性磷酸酶定量測定 堿性磷酸酶定量測定結果，見表2。聯(lián)合誘導組OD值于第3、5、7 d分別為（9.02±3.21）、（12.65±2.87）和（15.43±1.75），OD值均高于鈣化誘導組，且兩組差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，聯(lián)合誘導組MSCs的ALP的表達活性有明顯的增強。

表2 鈣化組與聯(lián)合組骨髓基質干細胞ALP的活性測定OD值)

表2 鈣化組與聯(lián)合組骨髓基質干細胞ALP的活性測定OD值)

注：與鈣化組比較，*P＜0.05；與對照組比，﹟P＜0.05

組別鈣化組聯(lián)合組空白組1 d 3.88±2.09 5.11±0.99 2.34±1.09培 養(yǎng) 時 間 (d) 3 d 5.38±1.39 9.02±3.21*﹟3.34±1.67 5 d 8.33±3.80 12.65±2.87*﹟5.55±3.52 7 d 9.77±2.91 15.43±1.75*﹟8.34±2.82

3 討論

種子細胞的選擇是組織工程骨的構建中關鍵的基礎。近年來，MSCs因其取材方便、損傷小及成骨能力確切[4]，正逐漸成為組織工程中較理想的種子細胞。MSCs作為多能干細胞具有多種分化潛能，但其定向成骨分化不是完全自發(fā)的過程，應用何種誘導方法，如何在較短時間內體外獲得大量的種子細胞，是組織工程骨構建的關鍵任務之一。

目前報道已知的誘導MSCs向成骨細胞分化的因子，主要有地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉等，并已成為經(jīng)典誘導方法，對其誘導機制及誘導結果報道已很多。地塞米松在促進MSCs向成骨細胞分化的同時提高ALP的活性，促進細胞外基質膠原合成。維生素C的作用是促進培養(yǎng)的細胞合成膠原，形成鈣化，并能調節(jié)ALP和非膠原基質蛋白的合成。β-甘油磷酸鈉在培養(yǎng)液中迅速被ALP水解，產(chǎn)生大量磷酸離子，促進生理性鈣鹽的沉積和鈣化，是MSCs發(fā)生鈣化結節(jié)沉積的必要條件。

1984以來，對于自體富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)在MSCs誘導成骨中的作用，已逐漸受到重視，為一種更優(yōu)的成骨定向誘導法[5]。PRP是自體全血經(jīng)過梯度離心、分離得到的血小板濃縮物，血小板含量豐富，PRP具有來源于自體、無免疫排斥、對機體損傷小等優(yōu)點[6]，當血小板激活時，能釋放多種生長因子，其中以血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)最為重要，各生長因子的比例與體內正常比例相似，并具有最佳的協(xié)同作用[7]。

本實驗將經(jīng)典誘導方法和最新報道的PRP誘導方法聯(lián)合起來，作為一種新的成骨誘導方法，來證實這種聯(lián)合方法能夠協(xié)同發(fā)揮誘導MSCs增殖與成骨定向分化的作用，并初步的探討其可能的影響機制。在本實驗中，MTT細胞增殖檢測顯示于細胞對數(shù)增長期，聯(lián)合誘導組細胞增殖率高于傳統(tǒng)鈣化誘導組（P＜0.05）。證實PRP與經(jīng)典礦化誘導方法聯(lián)合應用，對MSCs的增殖有著確切的協(xié)同促進作用[8]，但其確切的機制有待進一步證實。應用ALP及鈣結節(jié)染色的方法，證實此聯(lián)合誘導的方法與傳統(tǒng)鈣化誘導方法有著相似的陽性結果，說明聯(lián)合誘導同樣能誘導MSCs向成骨細胞分化。為了進一步證實兩組ALP表達有無差異，本實驗亦進行了ALP的定量檢測。

ALP是成骨細胞分化成熟的標志性酶之一[9]，能夠反映成骨細胞合成I型膠原、形成骨基質的能力，故ALP表達的高低能客觀的反映出誘導MSCs向成骨細胞的效果[10]。在本實驗中，堿性磷酸酶定量測定顯示聯(lián)合誘導組于第3、5、7 d，OD值均高于鈣化對照組，證實此聯(lián)合誘導方法能夠對誘導MSCs定向分化為成骨細胞起到協(xié)同作用，比對照組有更大的成骨促進作用。其原因可能為：一是PRP中TGF-β可增強MSCs轉化為成骨細胞的數(shù)量和活性；同時成骨細胞可通過自分泌和旁分泌TGF-β，刺激MSCs向成骨細胞轉化[11]。二是PRP與地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉均有促進MSCs的增殖的作用，尤其地塞米松的作用最為重要，可轉化的MSCs細胞數(shù)量的增加亦使ALP的表達增加。三是可能因為PRP內各種因子間協(xié)同作用促進MSCs向成骨細胞轉化。另外，有地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉，則能提高已轉化的成骨細胞表達ALP的活性，尤其以β-甘油磷酸鈉作用為主。但是聯(lián)合誘導時，多種因子之間確切的協(xié)同作用還有待進一步的研究證實。

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（收稿：2009-02-02 修回：2009-11-16）

（責任編輯 劉洪斌 田在善）

Effect of Platelet-rich PlasmaCombined with Calcifying Inductors on Proliferation and Osteogenetic Activity of Bone Mesenchymal Stem Cells

Ma Xinlong,Sun Xiaolei,Ma Jianxiong,et al. Dept.of Bone, Tianjin Medical University,Tianjin（300052）,China

Objective To observe the effect of the combined inductors of platelet-rich plasma(PRP)and vitamin C,dexamethasone and β-sodium glycerophosphate on the proliferation mesenchymal stem cells of MSCs and osteoblastic induction in vitro. Methods The MSCs were cultured by density gradient centrifugation and adherence screening from rabbit flank bone.The 3rd MSCs was randomly divided into 3 groups.In the blank group the DMEM medium was used including 10%FCS.In calcifying control group the calcifying DMEM medi?uim was used including 0.1 μmol/L dexamethasone,50 mg/L vitamin C and 10 mmol/Lβ-sodium glycerophos?phate.In the combined inductors group the DMEM medium was used including 1%PRP and calcifying induc?tors,by 8 days of induction. Results The 3rd MSCs mainly showed polygon and whirlpool-like growth.After cultured for 5 days,the alkaline phosphatase staining of the black group showed weak positive,the alkaline phos?phatase staining of the two other groups showed positive.Cultured 21 days later,the calcium node staining showed positive.The MTT assay showed the cell proliferation of calcifying control group was significantly higher than combined inductors group on the 2nd to 5th days(P＜0.05).ALP quantitative assay showed the OD of the combined inductors group were higher than calcifying control group in 3,5 and 7th d(P＜0.05). Conclusion The combined inductors methods using 1%PRP and dexamethasone,vitamin C and β-sodium glycerophosphate is much better than that using calcifying inductors.The proliferation and osteogenetic activity of the induced os?teoblast are superior.

platelet-rich plasma,bone mesenchymal stem cells，osteogenetic activity

R681.2

A

1007-6948(2010)02-0195-05

天津醫(yī)科大學科學基金（2005ky53）

1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科（天津300052）

2.天津醫(yī)院骨研所（天津300211）

孫曉雷，Tel：022-60362062，E-mail:sunden815@yahoo.cn