朱崎 肖偉升 歐瑜 廖愛軍

RASSF1(Ras-assotiation domain family1)即Ras相關區(qū)域家族1基因，是Dammann以及 Lerman分別在2000年從肺癌細胞株3號染色體短臂克隆的新型候選抑癌基因[1-2]，它有多種不同mRNA剪接體，包括RASSF1A/B/C。研究表明，RASSF1A在所有的正常組織中均表達，但是在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、腎癌、前列腺癌和膀膚癌等絕大多數(shù)腫瘤中卻表達缺失，目前研究表明，胃癌中46%癌組織和33%的細胞系中存在RASSFIA表達缺失，與腫瘤分級、分期有關，但與組織學類型無關[3]。有作者研究胃癌、胃腺瘤、腸上皮化生、慢性胃炎四種病變的甲基化譜，發(fā)現(xiàn)RASSFIA啟動子甲基化只見于胃癌中[4]。這些研究結(jié)果提示RAssFIA表達缺失在胃癌發(fā)生發(fā)展中是常見事件，可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。但RASSF1A基因與結(jié)直腸癌是否相關尚未見相關報道。本實驗通過RT-PCR檢測結(jié)直腸癌中RASSF1A的表達水平探討RASSF1A基因與結(jié)直腸癌的關系。

1 材料及方法

1.1 病例標本來源 來自2009年5月～9月我院腫瘤外科結(jié)直腸癌手術患者，共40例，40例病例中男24例，女16例，年齡在26～68歲。所有標本均經(jīng)兩名高年資病理醫(yī)師閱片確診，取距離腫瘤邊緣5cm外組織作為正常對照。所有標本均保存在-180℃液氮中待用。組織標本按TNM分期。按組織分化分級。

1.2 組織總RNA的提取 按照Trizol試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)操作說明書提取總RNA。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工)操作說明書，取上述提取的總RNA5μl、Oligo(dT)12～181μl、去離子水6μl，共置于PCR管中，渦旋器上輕微混勻3～5s，以上均冰上操作。70℃孵育5min后，冰上冷卻，4000r/min離心10s。然后分別加入5×反應緩沖液4μl，RNA酶抑制劑(20u/μl)1μl，10mmol/L)dNTP2μl，混勻，4000r/min離心10 s，收集產(chǎn)物。42℃孵育5min。加AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl)1μl,終體積為20μl。42℃孵育60min。70℃加熱10min。置-20℃保存。

1.4 PCR擴增 根據(jù)相關文獻合成擴增RASSF1A的引物：上游引物5′-TCT GGG GCG TCG TGC GCA AA-3′，下游引物5′-GAA CCT TGA TGA AGC CTG TG-3′，擴增產(chǎn)物長285bp；以在各種組織中穩(wěn)定表達的β-actin作為內(nèi)參，上下游引物分別為：5′-ACC CAG ATC ATG TTT GAG ACC-3′，5′-GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′，擴增產(chǎn)物長486bp。按照PCR擴增試劑盒(上海生工)的操作說明書進行。反應條件：95℃預變性4min；95℃變性30sec；60℃退火30s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)；72℃延伸5min。產(chǎn)物置-20℃保存。

1.5 瓊脂糖電泳 擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用BIO-RAD圖象分析儀掃描記錄。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用x2檢驗和秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RASSF1A基因在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達RASSF1A mRNA在40例結(jié)直腸癌組織中有90.0%(36/40)表達缺失；而只有12.5%(5/40)癌旁正常組織中存在表達缺失，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1。

2.2 RASSF1A基因在結(jié)直腸癌中的表達與組織分化、臨床病理的關系RASSF1A基因mRNA表達缺失與結(jié)直腸癌組織分化程度可能不相關，高分化、中分化、低分化比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，與結(jié)直腸癌病理分期可能不相關，病理分期間比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。見表1。

圖1 RASSF1A基因在結(jié)直腸癌中的表達

3 討論

RASSF1A目前被認為是一個新型的抑癌基因，首先在肺癌中發(fā)現(xiàn)，并且隨著對RASSF1A基因研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)RASSF1A通過多種途徑抑制腫瘤的形成，而其失活參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，研究已經(jīng)在乳腺癌，前列腺癌，鼻咽癌，卵巢癌，黑色素瘤，淋巴瘤，膀胱癌，胃癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)了RASSF1A的表達缺失或表達下調(diào)。

表1 RASSF1A基因mRNA在結(jié)直腸癌中的表達

RASSF1A被認為是一種Ras效應分子，通過RAS結(jié)構域與Ras-GTP結(jié)合，誘導細胞凋亡[5]。在正常的細胞中，Ras的這兩種效應可能通過動態(tài)的平衡來維系細胞正常生長，而在腫瘤中因甲基化所引起的RASSF1A表達缺失可能使Ras更多的發(fā)揮促進細胞生長效應而最終導致腫瘤發(fā)生。PallarésJ等[6]在子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)RASSF1A通過Ras-MAPK通路影響細胞增殖及凋亡。YooYA等[7-8]發(fā)現(xiàn)RASSF1A能抑制H-Ras誘導的JNK活性。Thaler等[9]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)RASSF1A能調(diào)節(jié)Ras介導的Raf-MEK-ERK信號通路，從而影響細胞周期及衰老。RASSF1A作為Ras的一種效應分子已經(jīng)得到證實。而進一步研究表明RASSF1A可通過MST1(Mammalian sterile20likekinase 1)[10-12]、支架蛋白CNK1(connector enhancer of KSR)[13]、MOAP1(modulator of apoptosis-1，一種Bax結(jié)合蛋白)[14-16]、Cyclin D1(細胞周期蛋白D1)[7-17]、CDC20(cell division cycle control protein20,細胞分化周期調(diào)控蛋白20)[18-19]影響細胞的凋亡，并且認為RASSF1A還能通過ATM磷酸化位點調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)定性[20-21]。

這些研究表明了RASSF1A基因能抑制腫瘤的生長，誘導凋亡，是腫瘤的發(fā)病機制，但RASSF1A基因是否在結(jié)直腸癌中也存在著表達缺失，RASSF1A基因是否是結(jié)直腸癌的抑癌基因，目前國內(nèi)外尚無研究。我們的實驗結(jié)果表明：結(jié)直腸癌旁組織的RASSF1A基因mRNA表達的缺失率(90%)明顯高于癌組織(12.5%,P＜0.05)。這說明RASSF1A基因可能與結(jié)直腸癌相關，并且可能是結(jié)直腸癌的一個抑癌基因。進一步研究表明：RASSF1A基因的表達與結(jié)直腸癌的組織分化及病理分期間無明顯關系(P值均＞0.05)這可能說明RASSF1A基因與結(jié)直腸癌的組織分化及病理分期關系不大，但也有研究表明在RASSF1A基因與胃癌的進展相關，RASSF1A基因是否確定與結(jié)直腸癌的組織分化及病理分期無關，需進一步擴大標本量來證明。

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