馬利青,蔡其剛,陸 艷

(青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧 810016)

寄生于羊的隱孢子蟲主要對羔羊致病,輕者消瘦、阻礙生長,重者引發(fā)腹瀉,甚至死亡,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。寄生于綿羊和山羊的隱孢子蟲中,微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、人隱孢子蟲(C.hominis)、豬隱孢子蟲(C.suis)和隱孢子蟲鹿基因型(Cervinegenotype)為人獸共患蟲種和基因型[1]。在羊場飼養(yǎng)員中隱孢子蟲感染陽性率明顯高于非飼養(yǎng)人員,表明羊是人隱孢子蟲病的一個(gè)保蟲宿主[2]。

為了解青海省羔羊群中隱孢子蟲的感染情況,我們于2009年5～8月份用純化的C.parvum重組蛋白P23作為ELISA診斷抗原進(jìn)行了羔羊隱孢子蟲病的血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 重組的C.parvum P23蛋白按文獻(xiàn)記載的方法[3]進(jìn)行了克隆、表達(dá)和純化;陰、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清由日本國家原蟲中心玄學(xué)南博士惠贈(zèng),青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院生物技術(shù)研究室保存。

1.2 被檢血清的采集和處理

1.2.1 671份被檢血清均采自剛察縣某羊場、共和縣某羊場、海晏縣某羊場和烏蘭縣某羊場的3～6月齡當(dāng)年羔羊。

1.2.2 采血時(shí)均空腹、頸靜脈采集,采集后擺成斜面,置4℃冰箱5 h后,放在室溫待血清析出后收集血清,-20℃冷凍保存待檢。

1.3 其他試劑和耗材 均購自國內(nèi)和Sigma公司供應(yīng)商。

1.4 ELISA

1.4.1 抗原的包被 抗原 P23和GST,按 5μg/mL劑量加到包被液中(50 mmol/L carbonate-Bicarbonate Buffer,pH值9.6),混勻后加到96孔平底微量板(Nunc,Denmark)的孔里,每孔 50μL,并且在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween-20的PBS沖洗1次后,殘留的粘附物的部位用含3%脫脂乳的封阻液進(jìn)行封阻,每孔 100μL,并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.3 加樣 隨后微量板用沖洗液沖洗1次,在封阻液中按1∶100滴度稀釋被檢血清后,每個(gè)樣品平行加到微量板的兩個(gè)孔中,每孔50μL,并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.4 加二抗 用沖洗液沖洗6次后,在封阻液中按1∶4000滴度稀釋辣根過氧化物酶結(jié)合了兔抗羊的IgG抗體(Bethyl Laboratories,USA),稀釋后每孔加50μL,并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.5 底物 用沖洗液沖洗6次后,每孔加100μL底物,每毫升底物中含有0.3 mg的2,2′azino bis(3 ethylbenz thiazoline 6 sulfonic acid),0.1 mol/L的檸檬酸,0.2 mol/L的磷酸緩沖液和0.003%H2O2,每孔加 100μL 。

1.4.6 讀數(shù) 用Wellscan MK 3酶標(biāo)讀數(shù)儀(Labsystems Dragon,Finland)在光吸收值OD415 nm條件下測定光吸收值。

1.4.7 判定標(biāo)準(zhǔn) ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù),且展示ELISA值是等于或大于0.1,在抗原P23孔和 GST孔之間的光密度吸收值是不同的,兩個(gè)孔之間的差值為該被檢樣品的光密度吸收值(OD值)。兩孔陽性血清對照孔的平均值必須大于0.1;兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.1;兩孔待檢樣品的平均值等于或大于 0.1為陽性,低于 0.1為陰性。

2 結(jié)果

在所檢測的671份血清中,檢出C.parvum抗體陽性血清153份,陽性率為 22.80%。綿羊群中羔羊隱孢子蟲的流行情況檢測結(jié)果。見表1。

表1 綿羊群中羔羊隱孢子蟲的流行情況檢測結(jié)果

3 討論

3.1 從本次檢測的結(jié)果來看,本省羔羊群中不同程度的感染了C.parvum。

3.2 Brackett E J等[4]發(fā)現(xiàn)6頭有嚴(yán)重隱孢子蟲病小牛多數(shù)糞樣中抗 p23抗體也成倍的增加,經(jīng)研究認(rèn)為,無論是在子孢子還是小配子階段,p23是C.parvum感染的體液免疫反應(yīng)的一個(gè)主要靶抗原,序列同源性的分析結(jié)果證明 P23蛋白是C.parvum的保守蛋白;同時(shí),重組p23抗原免疫引起感染隱孢子蟲的IFN-γ基因敲除Balb/c鼠的脾細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞特異地增生性反應(yīng),表明p23也是細(xì)胞免疫反應(yīng)的一個(gè)重要的靶抗原。C.parvum的糖蛋白P23與蟲體的附著和入侵宿主細(xì)胞有關(guān),也是發(fā)病機(jī)制中推測的毒力因素之一,被公認(rèn)為隱孢子蟲診斷和疫苗制作的侯選基因之一[5]。

3.3 本試驗(yàn)中應(yīng)用蛋白重組技術(shù),獲得P23重組蛋白,建立了基于P23蛋白的ELISA檢測技術(shù),并用于田間樣品的檢測,這為今后進(jìn)一步開發(fā)C.parvum的ELISA診斷試劑盒打下了一定的基礎(chǔ)。

[1]Xiao L,Fayer R,Ryan U,et al.Cryptosporidium tax onomy:Recent advances and implications for public health[J].Clin Microbiol Rev,2004,17:72-97.

[2]El-Sherbini G T,Mohammad K A.Zoonotic cryptosporidiosis in man and animal in farms,Giza Governorate,Egypt[J].J Egypt Soc Parasitol,2006,36(2 Suppl):49-58.

[3]T akashima Y,Xuan X,Kimata I,et al.Recombinant bovine herpesvirus-1 expressing p23 protein of Cry ptosporidium parvum induces neutralizing antibodies in rabbits[J].J Parasitol,2003,89(2):276-282.

[4]Brackett E J,M ason P H,Savidge J,et al.Excretion patterns of mucosally delivered antibodies to p23 in Cryptosporidium parvum infected calves[J].Vet Immunol Immunopathol,2000,76(3-4):309-317.

[5]Watts A M.Kennedy RC1 DNA vaccination strategies against infectious Diseases[J].Vaccine,1999(29):1149-1163.