孫巍巍，包海鷹

（吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118）

松杉靈芝 （Ganoderma tsugae Murr.） 為擔子菌綱 （Basidiomycetes）、 多孔菌目 （Polyporales）、 多孔菌科（Polyporaceae）、靈芝屬 （Ganoderma）真菌，子實體一年生，是1種珍貴的藥用真菌。靈芝具有多種活性物質(zhì)，其中多糖和三萜被認為是主要藥效成分。大量報道表明靈芝具有廣泛的藥理作用，例如保肝、抗腫瘤、抗微生物、抗高血壓、抗HIV－1及HIV－l蛋白酶、鎮(zhèn)靜、抗疲勞、耐缺氧、抗氧化作用等[1]，有學者對松杉靈芝子實體熱水提取物和甲醇提取物的抗氧化性進行研究，結(jié)果表明這兩種提取物都具有較好的抗氧化活性[2，3]。本實驗采用3種方法對松杉靈芝子實體不同有機溶劑提取物進行體外抗氧化活性研究，為松杉靈芝的藥用價值開發(fā)提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 材料

松杉靈芝子實體采自吉林省長白山，由吉林農(nóng)業(yè)大學菌物研究所圖力古爾教授提供并鑒定。

1.2 主要儀器設備

PL303電子天平，梅特勒－托利多儀器有限公司；HH CP－O1W二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TU－1800紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Polytron組織勻漿器，上海東富龍有限公司；GL－20G－Ⅱ離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗試劑及藥品

1,1－二苯基－2－苦基肼自由基 （·DPPH） 和細胞色素C（CytC）均購自Sigma公司；抗壞血酸 （Vc）為食品級；三羥甲基氨基甲烷 （Tris）、FeSO4、 三氯醋酸 （TCA）、 硫化巴比妥酸 （TBA）、 無水乙醇、CuSO4、 Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O和硫脲等均為分析純。

2 方法

2.1 供試藥品的制備

將1.5 kg松杉靈芝子實體粉碎，依次用石油醚、氯仿、甲醇和蒸餾水回流提取3次，除了石油醚的提取溫度是35℃外，其它提取溫度均為60℃，每次提6 h，合并提取液，過濾，濃縮，干燥，分別得到石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物和水提取物。稱取松杉靈芝石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物、水提取物各100 mg，分別用氯仿、氯仿、甲醇和蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，配成濃度為2 mg·mL-1的樣品母液，然后將樣品母液用溶劑逐級稀釋成濃度為 2 mg·mL-1、 1 mg·mL-1、 0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、 0.125 mg·mL-1、 0.0625 mg·mL-1的樣品溶液待用。

2.2 抗氧化試劑的配制

2.2.1 清除·DPPH自由基試劑的配制

·DPPH溶液：準確稱取0.01 g的·DPPH，用無水乙醇定容至50 mL容量瓶中作為母液，取10 mL母液用無水乙醇定容于50 mL容量瓶中，最終濃度為0.04 mg·mL-1，避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 大鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化試劑的配制

Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1， pH7.4）： 稱 Tris 0.24228 g，加 50 mL蒸餾水，HCl 0.17 mL，稀釋到 50 mL， 取 HCl 42 mL與 50 mL Tris混勻備用；FeSO4·7H2O（10 μmol·L-1）溶液： 稱 FeSO4·7H2O 0.0508 g， 加 10 mL Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1， pH7.4）， 用時稀釋 1000倍；0.1 mmol·L-1的 Vc溶液： 取 Vc 0.0176 g， 加 10 mL Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1， pH7.4）， 用時稀釋 100倍；三氯醋酸 （TCA 28%）溶液：稱三氯醋酸2.8 g，加10 mL Tris-HCl緩沖液；硫代巴比妥酸 （TBA 1%）溶液：稱 TBA 0.2 g，加 20 mL Tris-HCl緩沖液；陽性對照（BHA 500 μg·mL-1）： 準 確稱 取 BHA 50 mg， 加 10 mL Tris-HCl緩沖液。

2.2.3 清除羥自由基試劑的配制

磷酸鈉鹽緩沖液 PBS （0.15 mmol·L-1， pH7.4）： 取Na2HPO4·12H2O 0.0042 g， 加入蒸餾水77.4 mL， 取NaH2PO4·2H2O 0.0023 g， 加蒸餾水 100 mL， 從中取 22.6 mL與上列溶液混勻，可放于4℃冰箱保存；Vc（100 μmol·L-1）溶液：稱Vc 0.0176 g，加10 mL磷酸鈉鹽緩沖液 （0.15 mmol·L-1， pH7.4）， 用時稀釋 100 倍； CuSO4（100 μmol·L-1）溶液： 稱取 CuSO4·5H2O 0.039 g， 加10mL 磷酸鈉鹽緩沖液 （0.15 mmol·L-1，pH7.4）， 用時稀釋 100倍；細胞色素 C （12 μmol·L-1）： 每2毫升 15 mg， 稀釋 50 倍備用； 陽性對照 （硫脲2 μg·mL-1）： 稱硫脲2 mg， 加磷酸鈉鹽緩沖液 （0.15 mmol·L-1， pH7.4）10 mL， 用時稀釋100倍。

2.3 抗氧化的測定

2.3.1 清除·DPPH自由基的測定

將石油醚提取物、氯仿提取物、甲醇提取物、水提取物溶液分別分為A、B、C三組。A組：2 mL樣品溶劑和2 mL·DPPH溶液；B組：2 mL樣品溶液和2 mL·DPPH溶液；C組：2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇。加入反應液后搖勻，于室溫避光靜置30 min，轉(zhuǎn)移至比色皿內(nèi)，在517 nm處測定吸光度值。每組做6個平行，計算各樣品對·DPPH的清除率[4]。各樣品對·DPPH自由基的清除能力(SA)公式為:

SA=[A-(B-C)]/A×100%

式中：A、B、C分別為A組、B組、C組所測得的吸光度值。

2.3.2 大鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化作用的測定

大鼠用乙醚麻醉至昏迷，快速斷頭處死后，迅速剝離腦組織，4℃生理鹽水反復沖洗，洗去血污，濾紙吸去生理鹽水，稱腦重量。將腦剪成小塊后，用Polyron電動勻漿器， 加入冰凍 Tris-HCl緩沖液 （20 mmol·L-1，pH7.4）得1/10（重量體積比）腦勻漿，冰浴中迅速用勻漿機以18000 r·min-1的速度，打漿3次，每次10 s，間隔30 s，制備成腦勻漿 （1∶10， w·v-1）， 4℃離心 （2000 r·min-1， 20 min），將勻漿中的上清液均分為1 mL，加入1 mL待測樣品， 1 mL 10 μmol·L-1的 FeSO4和 1 mL 0.1 mmol·L-1的 Vc的試管中，于37℃保溫1 h，保溫結(jié)束后，加入1.0 mL三氯醋酸 （TCA，28%）終止反應，再加1.5 mL硫化巴比妥酸 （TBA，1%），于100℃加熱15 min，離心除去蛋白質(zhì)后，于532 nm測定丙二醛 (MDA)-TBA復合物的吸光度， 抑制率 （P） 公式[5]為：

P=(A-A1)/A×100%

式中：A為對照的吸光度；A1含待測樣品體系的吸光度。

2.3.3 羥自由基清除活性的測定

精密量取 3.0 mLPBS （0.15 mmol·L-1， pH7.4， 下同）和30μL CuSO4于試管中，混勻作空白參比管；精密量取PBS 3.0 mL、 CuSO430μL、 維生素 C 30μL、 細胞色素 C 60μL、蒸餾水0.5 mL作為對照；精密量取PBS 3.0 mL，CuSO430μL、 維生素 C 30μL、 細胞色素 C 60μL， 各待測樣品0.5 mL作為待測組；精密量取PBS 3.0 mL、CuSO430μL、 維生素 C 30μL、 細胞色素 C 60μL、 硫脲 3μL作為陽性對照。將上述試管同時置于25℃恒溫水槽中保溫90 min后，在550 nm測吸光度值A。每處理重復5次，硫脲作為陽性對照，將空白抑制率視為100%。羥自由基清除活性 （A） 公式[6]為：

A=(T-T2)/(T-T1)×100%

式中：T為羥自由基 （·OH）產(chǎn)生體系的透光值；T1為對照體系 （無·OH）的透光值；T2為含待測樣品體系的透光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 清除·DPPH的測定

松杉靈芝提取物清除·DPPH自由基的情況見表1。

實驗結(jié)果如表1所示，各提取物都具有一定清除·DPPH活力的能力，隨著提取物濃度的增加，清除率增高，可見提取物的抗氧化性與提取物的濃度呈量效關系。甲醇組的抗氧化能力略高于水組，在2 mg·mL-1時的清除率分別為68.73%和65.28%；石油醚組次之，最大清除率為57.78%；氯仿組清除·DPPH的能力最低，最大清除率為51.56%。

表1 松杉靈芝提取物清除·DPPH自由基的能力

3.2 體外大鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化作用的測定

松杉靈芝提取物對脂質(zhì)過氧化的抑制情況見表2。

從表2中可知，各層提取物的抑制率都隨濃度的提高而增大，各提取物都具有抑制脂質(zhì)過氧化效果，甲醇層的抑制能力最強，在2 mg·mL-1時的抑制率為64.55%，稍高于水層的最大抑制率59.72%，然后依次是石油醚層和氯仿層，兩者的最大抑制率相近，分別為55.63%和49.31%。在濃度為 0.5 mg·mL-1時，陽性藥 BHA的抑制率達到81.71%，抑制作用均大于松杉靈芝各層提取物。

表2 松杉靈芝提取物對脂質(zhì)過氧化的抑制能力

3.3 羥自由基清除活性的測定

松杉靈芝提取物清除羥自由基能力見表3。

表3 松杉靈芝提取物清除羥自由基能力

從表3可以看出，各提取液都具有清除·OH能力，且都具有較好的量效關系。水層的清除能力最強，在濃度為2 mg·mL-1時的清除率達到100%，其余各組的的最大清除率分別為甲醇層81.26%、氯仿層75.07%、石油醚層60.34%。陽性藥硫脲在濃度為 2 μg·mL-1時的清除率為76.78%，水層和甲醇層在2 mg·mL-1時清除·OH的能力均超過陽性藥，尤其是水層具有極好的清除效果。石油醚層的清除效果最弱，在濃度達到1 mg·mL-1時，清除率隨濃度的增大不再明顯提高。

4 小結(jié)與討論

松杉靈芝不同溶劑提取物都具有較好的抗氧化作用，并且隨著提取物濃度的增加，抗氧化作用也逐漸增強。各組對·DPPH的清除能力：甲醇組＞水組＞石油醚組＞氯仿組；對脂質(zhì)過氧化的抑制能力：甲醇組＞水組＞石油醚組＞氯仿組；對·OH的清除能力：水組＞甲醇組＞氯仿組＞石油醚組。在清除·DPPH的實驗中，各層的提取物均具有清除·DPPH的能力，·DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能夠清除它，則提示受試物具有減低羥基自由基、烷基自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應的作用[7]；在抑制脂質(zhì)過氧化的實驗里，各層提取物均具有一定的抑制作用，可能與各提取物中含有酚類、三萜類、多糖類等抗氧化物質(zhì)的含量及組成有關；在清除·OH的實驗中，有學者研究表明松杉靈芝子實體熱水提取物對羥自由基具有很好的清除力[2]，與本實驗中水層對羥自由基具有很好的清除效果相符，表明松杉靈芝提取液清除·OH的物質(zhì)極性較大，能更多溶于水和甲醇中。從以上抗氧化實驗推測，不同溶劑提取物清除自由基的種類不同，說明其抗氧化組份不同，在甲醇組中清除·DPPH和抑制脂質(zhì)過氧化的物質(zhì)多，在水層中清除·OH的物質(zhì)多，由于提取液成分復雜，各物質(zhì)之間可能相互影響，具體的清除物質(zhì)成分還需近一步研究。眾所周知，自由基損傷參與多種疾病的病理生理過程，如炎癥、免疫失調(diào)、動脈粥樣硬化、惡性腫瘤、衰老等，研究和開發(fā)抗氧化劑和自由基清除劑對疾病的防治有重大意義。目前國內(nèi)外也已將抗氧化檢測用于抗衰老等保健食品的評價，對保健食品的開發(fā)具有積極作用。由此可見，松杉靈芝在抗氧化、抗衰老等方面有較大的可挖掘潛能。

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