陳瑞林， 陶 怡， 黃文輝

(廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東 廣州 510260)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的全身性自身免疫性疾病，呈慢性侵蝕性的炎癥過程［1］。RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全闡明，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)及凋亡異常被認(rèn)為是RA發(fā)病的重要機(jī)制。本研究通過檢測漢族人群RA患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群情況，明確RA患者是否存在異常T細(xì)胞亞群的擴(kuò)增及其與外周血淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，以探討T淋巴細(xì)胞亞群異常增殖在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑和儀器 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液;PE－Cy5標(biāo)記的CD3單抗，PE標(biāo)記的CD4單抗及其同型對照;FITC標(biāo)記的CD28單抗及其同型對照(Beckman Coulter);磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白(Annexin V)－FITC;碘化丙啶(PI)(深圳晶美生物公司);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)。

1.2 病人資料 2005年12月－2007年12月在本院風(fēng)濕免疫科就診的RA患者50例，其中37例女性和13例男性，平均年齡(50.12±13.8)歲(24－82歲)，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1982年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有RA患者均為新近診斷或在進(jìn)入研究前1個月無服用緩解病情抗風(fēng)濕藥(DMARD)藥物或激素;如患者服用非甾體抗炎藥(NSAID)，在進(jìn)入研究前1個月劑量已穩(wěn)定。健康對照組50名，(女性30名，男性20名)，平均年齡(45.25±14.24)歲(22－65歲)，經(jīng)問診和體檢排除自身免疫性疾病史。2組間年齡無顯著差異。

2 方法

2.1 外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的制備 抽取清晨空腹靜脈血20 mL，肝素抗凝，在收集標(biāo)本后1 h內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞的分離、培養(yǎng);采用Ficoll Hypaque密度梯度離心法，在淋巴細(xì)胞分離液和血漿層間收集淋巴細(xì)胞后，用PBS洗滌，一部分直接檢測細(xì)胞表型及凋亡，一部分在RPMI－1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 23例RA患者和24例健康對照者的淋巴細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，2組均加入培養(yǎng)液:含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酸和1×105U/L青霉素－鏈霉素的RPMI－1640完全培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組再加入植物血凝素(phyto－h(huán)emagglutinin，PHA)(終濃度為10 mg/L)刺激淋巴細(xì)胞以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖活化;均在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后收集懸浮細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞表型檢測 新鮮分離的淋巴細(xì)胞用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/L，吸取100 μL細(xì)胞懸液，加入FACS測定管，待測淋巴細(xì)胞懸液加入熒光標(biāo)記的抗體CD3－PE－Cy5、CD4－PE、CD28－FITC各10 μL組合標(biāo)記，并設(shè)立同型對照，混勻后室溫避光孵育20 min，取出后每管加入PBS 1 mL，混勻后水平離心機(jī)1000 r/min離心5 min，棄上清以洗去未結(jié)合的熒光單抗，流式細(xì)胞儀三色分析法檢測細(xì)胞免疫表型。每份標(biāo)本分析5000－6000個細(xì)胞。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測 培養(yǎng)24 h的淋巴細(xì)胞以結(jié)合緩沖液洗滌后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/L，加入AnnexinV－FITC和PI，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。同時設(shè)立陰性對照。計(jì)數(shù)10000個細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 CD4+T淋巴細(xì)胞CD28的表達(dá)水平

流式細(xì)胞術(shù)三色分析法對新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行表型分析。RA組CD4+CD28－T細(xì)胞比例的均數(shù)明顯高于健康對照組(7.79%±3.52%vs 1.89% ±1.78%，P＜0.05)，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖2。

2 淋巴細(xì)胞的凋亡率

對照組(即不加任何刺激劑進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞)RA病人和正常人的淋巴細(xì)胞自發(fā)性凋亡水平無顯著差異(4.23% ±1.96%vs 3.33% ±3.01%，P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組(加入PHA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化)RA組病人外周血淋巴細(xì)胞的激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(activation－induced cell death，AICD)凋亡率顯著低于健康對照組(11.38% ±5.73%vs 19.46% ±6.32%，P＜0.05)，見圖3。

Figure 1.A significantly higher fraction of CD4+CD28－T cells was found in RA group compared with that in healthy control group.*P ＜0.05 vs healthy control group.n=50.圖1 RA組與正常組CD4+CD28－T細(xì)胞比例對比

Figure 2.In isolated lymphocytes from human peripheral blood，CD4+T cells were analyzed CD28 expression by flow cytometry.A:the CD28 expression in CD4+T cells in a healthy control;B:the CD28 expression in CD4+T cells in a RA patient.圖2 三色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型結(jié)果

Figure 3.The apoptotic level in PHA－cultured lymphocytes was significantly lower in RA group than that in healthy control group.*P＜0.05 vs PHA+healthy control group.(RA group n=23;healthy control group n=24).圖3 RA組與正常對照組淋巴細(xì)胞凋亡率比較

3 CD4+CD28－T細(xì)胞比例與淋巴細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

對RA組CD4+CD28－T細(xì)胞比例與淋巴細(xì)胞凋亡率進(jìn)行 Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示 CD4+CD28－T細(xì)胞比例與外周血淋巴細(xì)胞AICD凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r= －0.433，P ＜0.01)。

討 論

RA以滑膜增生、慢性炎癥和自身免疫進(jìn)程為特征，其免疫病理事件涉及循環(huán)中大部分的T細(xì)胞［2］，因此，對外周血淋巴細(xì)胞的研究可能更能反映患者的整體病理狀況。

CD28分子的觸發(fā)是T細(xì)胞接受刺激活化完全所必需的［3］。由于CD28分子重要的協(xié)同刺激功能，CD28在CD4+T細(xì)胞上組成性表達(dá)。但近來多個研究發(fā)現(xiàn)，幾種自身免疫疾病中，包括RA、韋格納氏肉芽腫、風(fēng)濕性多肌痛和強(qiáng)直性脊柱炎，外周血存在缺乏CD28表達(dá)的CD4+T細(xì)胞的擴(kuò)增［4－8］。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)三色分析法檢測新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞 CD4+CD28－的比例，發(fā)現(xiàn)在 RA病人中，CD4+CD28－T細(xì)胞的百分比明顯高于年齡相匹配的健康人(7.79% ±3.52%vs 1.89% ±1.78%，P＜0.05)，與國外報(bào)道的結(jié)果基本一致［4］。RA病人中的CD4+CD28－T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中一個獨(dú)特的亞群。近來研究已明確缺乏CD28表達(dá)的CD4+CD8－T細(xì)胞亞群，是免疫系統(tǒng)老化的一個最好的生物學(xué)指標(biāo)［9－11］，但并不清楚知道T細(xì)胞可以完成多少個細(xì)胞循環(huán)。T細(xì)胞在經(jīng)歷多個細(xì)胞分裂循環(huán)后進(jìn)入細(xì)胞衰老程序，細(xì)胞衰老有3個主要特征［12］:(1)功能的改變，例如產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子;(2)端粒長度的縮短，最終增殖停止;(3)對凋亡耐受。而細(xì)胞衰老最廣為人知的表型改變是CD28的丟失。研究認(rèn)為CD28－T細(xì)胞代表了衰老的淋巴細(xì)胞，其來自受抗原反復(fù)刺激的CD28+前體細(xì)胞［13］。因此，RA病人外周血T淋巴細(xì)胞可能在腫瘤壞死因子α(TNF－α)刺激下，CD4+T細(xì)胞丟失整合CD28起始區(qū)域的核蛋白，從而下調(diào)CD28在細(xì)胞表面的表達(dá)［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)RA病人外周血中CD4+CD28－T細(xì)胞比例增高和淋巴細(xì)胞凋亡率降低的同時存在，使我們推測是否由于CD4+CD28－T細(xì)胞的凋亡耐受作用而促成了RA外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)歷AICD時的凋亡率下降呢?當(dāng)我們進(jìn)行相關(guān)分析時，結(jié)果顯示CD4+CD28－T細(xì)胞比例與淋巴細(xì)胞凋亡率之間存在負(fù)相關(guān)(r= －0.433，P ＜0.01)，提示 CD4+CD28－T細(xì)胞比例增多，可能由于它們具備對AICD抵抗的能力，從而促進(jìn)了RA患者外周血活化淋巴細(xì)胞生存期的延長，并可能因此參與RA的發(fā)病機(jī)制。

由于在RA病人中CD4+CD28－T細(xì)胞的數(shù)目與他們的年齡不相符(明顯高于年齡匹配的正常對照)，因此我們推測CD4+CD28－T細(xì)胞在RA的病理狀態(tài)下代表過早衰老的T細(xì)胞，來自體內(nèi)被抗原重復(fù)激活的CD28+前體細(xì)胞，而且，CD28的丟失伴隨著其它新的致炎功能的獲得并長期存活從而導(dǎo)致了疾病相關(guān)的免疫異常。這些異常T細(xì)胞募集到組織部位可能與局部炎癥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)。自身耐受性需要一個功能齊全的免疫系統(tǒng)來鑒別自己和非己，可能由于異常T細(xì)胞亞群－CD4+CD28－T細(xì)胞的積聚，打破了機(jī)體的免疫平衡從而促成了RA的自身免疫表現(xiàn)。而RA病人存在過早的免疫衰老也為現(xiàn)有的臨床治療策略引進(jìn)新思路，尤其是，考慮采用免疫重建代替全身性的免疫抑制治療［15］。

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