彭朝權(quán)， 王景峰， 楊 珂， 張成喜， 何 可， 康 莊， 劉金來， 程木華， 鄒麗媛

(中山大學附屬第三醫(yī)院1心內(nèi)科，2放射科，3核醫(yī)學科，廣東 廣州 510630;4中山大學附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

動物模型被廣泛應(yīng)用于研究人類疾病，動物心肌梗死模型是研究冠心病發(fā)病機制和治療方法的重要工具。目前，用于建立心肌梗塞模型的常用實驗動物主要有:豬、犬、兔、羊、大鼠等。由于豬的心臟解剖、冠脈循環(huán)與人類似，特別是豬的血液黏稠度大，冠脈側(cè)支交叉分布較少，不易建立側(cè)支循環(huán)，故成為建立心肌梗死模型良好的選擇［1］。目前，建立心肌梗死動物模型的方法主要有:結(jié)扎法、球囊封堵法、栓塞法、血栓形成法、藥物法、冷凍法、選擇性飲食法及Ameriod環(huán)套扎法等。其中后兩者屬慢性心肌梗死模型［2］。球囊封堵法能夠減少實驗動物創(chuàng)傷，并能最大程度模擬臨床實際情況，但術(shù)中室顫和血栓形成等因素限制了該模型的應(yīng)用［3］。本文主要就球囊封堵法建立急性心肌梗死模型的可行性及注意事項進行探討，以提高建立小型豬心梗模型的成功率。并以此心梗模型初步探討間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療心肌梗死的效果。

材料和方法

1 實驗對象

8－12個月的成年小型藏豬(質(zhì)量合格證為 No.0038589)，雌雄不限，體重33－36 kg，購自南方醫(yī)科大學動物實驗中心。

2 材料

2.1 介入材料 橈、股動脈穿刺針，6F動脈鞘，各種導(dǎo)絲(造影導(dǎo)絲，指引導(dǎo)絲)，各種指引導(dǎo)管{6F左冠狀動脈指引導(dǎo)管(JL4.0)，6F右冠狀動脈指引導(dǎo)管(JR4.0)}，各種球囊(2.5 mm×15 mm、2.5 mm×18 mm)，壓力泵及換能器等。

2.2 監(jiān)護及搶救材料 監(jiān)護儀，心電圖機，除顫器，小手術(shù)包，氣管切開包，鼻導(dǎo)管，搶救藥品，麻醉藥品。

3 麻醉過程

3.1 藥物 速眠新Ⅱ，規(guī)格為1.5 mL/支的注射液，購自軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，批號為吉獸藥(2004)005013。戊巴比妥鈉，中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司進口分裝，25 g瓶裝粉劑，批號為F20030816。用生理鹽水配置成3%戊巴比妥鈉溶液，過濾消毒備用。地西泮注射液:規(guī)格為2 mL∶10 mg/支的注射液。

3.2 麻醉方法

①誘導(dǎo)期 動物術(shù)前8 h禁食，動物一般情況良好，無煩躁不安，無嗜睡淡漠，無嘔吐，肢體活動良好，血運正常。稱重，按0.1 mL/kg劑量速眠新Ⅱ聯(lián)合0.6 mg/kg劑量地西泮注射液臀部肌內(nèi)注射。給藥后幾分鐘即表現(xiàn)為四肢無力、步履蹣跚、頭頸下垂、不能避讓障礙物進而臥倒在地，全身肌肉松弛，痛覺消失。平均誘導(dǎo)期為30 min。

②維持期 將豬仰臥位固定雙上肢于特殊木架上，雙下肢于手術(shù)臺上，充分暴露雙側(cè)腹股溝。再以0.3 mL/mg的劑量耳后肌肉內(nèi)推注3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液。在維持期表現(xiàn)痛覺和觸覺消失，瞳孔散大，腹式呼吸，肌肉松弛，手術(shù)切割和內(nèi)臟牽拉無反應(yīng)。視術(shù)中動物肢體反應(yīng)于1－1.5 h追加3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液5－10 mL。保持麻醉狀態(tài)，監(jiān)測其生命體征。

③蘇醒期 術(shù)后基本生命體征穩(wěn)定后，不再追加麻藥，等待其自行蘇醒。

4 心肌梗死模型建立方法

4.1 術(shù)前準備 固定體位后，耳緣、胸部、四肢局部去毛，接心電監(jiān)護。用套管針在豬耳緣靜脈建立靜脈通路，持續(xù)靜脈滴注5%葡萄糖生理鹽水溶液，維持體液平衡。預(yù)防性使用抗心律失常藥物，胺碘酮300 mg、利多卡因500 mg于5%葡萄糖生理鹽水靜滴。做術(shù)前心電圖，接胸導(dǎo)聯(lián)及肢體導(dǎo)聯(lián)。觀察心電圖，理想心率應(yīng)低于110 beats/min，無期前收縮及傳導(dǎo)阻滯。

4.2 冠脈造影及球囊置入 常規(guī)消毒鋪巾，取豬右側(cè)腹股溝部位，可采用經(jīng)皮穿刺或切開分離出股動脈直接穿刺。經(jīng)皮穿刺時觸及股動脈搏動最強處，右手持針對準該點斜行平刺入，穿刺成功可見動脈血色鮮紅自針尾噴出，送入導(dǎo)絲。也可切開皮膚，鈍性分離暴露右側(cè)股動脈穿線，穿刺針小心刺入股動脈，通過穿刺針送入導(dǎo)絲，沿導(dǎo)絲送入6F動脈鞘管，隨即彈丸式靜脈注入肝素10000 U，手術(shù)過程中每隔30 min追加肝素2000 U。經(jīng)動脈鞘置入6FJL4指引導(dǎo)管。經(jīng)該導(dǎo)管置入球囊導(dǎo)絲至左前降支(left anterior desending coronary artery，LAD)遠端，經(jīng)該導(dǎo)絲置入直徑為2.5 mm×15 mm的球囊至第一或第二對角支遠端，以2－4個大氣壓打開球囊(根據(jù)冠脈的直徑大小選擇，以球囊擴張后造影遠端血流中斷為標準)，預(yù)適應(yīng)5－7次，第1次1 min，第2次2 min，第3次5 min，每次間隔5 min，第4次10 min，第5次15 min，第6次20 min，第7次30 min，每次間隔10 min。預(yù)適應(yīng)期間可預(yù)防性使用抗心律失常藥。觀察球囊堵閉過程中動脈內(nèi)壓力、心電圖ST－T變化及有無心律失常等。如出現(xiàn)頻發(fā)室早、短陣室性心動過速或心室顫動等情況可考慮延長預(yù)適應(yīng)時間，如無異常，則以2－4個大氣壓打開球囊堵閉LAD，造影示球囊遠端血流中斷，持續(xù)90 min之后，緩慢釋放球囊(0.5atm/5－10min)。再次造影觀察血供情況，血供良好退出鞘管，壓迫止血。術(shù)中連續(xù)心電監(jiān)護及鼻導(dǎo)管氧氣吸入，監(jiān)測心電圖、心率、呼吸、有創(chuàng)壓、血氧飽和度，發(fā)現(xiàn)異常時，立刻采取相應(yīng)措施。

4.3 術(shù)后護理 術(shù)后抗生素肌注3 d預(yù)防感染，第2 d恢復(fù)進食。

5 心梗模型成功的指標

心梗前后行心電圖(electrocardiogram，ECG)檢查，心梗后行超聲心動圖(echocardiography，UCG)、心肌核素顯像(single photon emission computed tomography，SPECT)、最后處死小型豬行梗死部位的病理檢查以證實心肌梗死已經(jīng)發(fā)生。

6 MSCs移植

將造模成功的10只小型藏豬隨機分為2組，MSCs移植組5只，采用OTW球囊移植MSCs到心梗部位，生理鹽水組5只，以相同方法注射生理鹽水。8周后比較2組的左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左室舒張末期內(nèi)徑(end diastolic volume，EDV)和左室收縮末期內(nèi)徑(end systolic volume，ESV)的變化。

7 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 球囊封堵情況

經(jīng)皮球囊封堵成功阻斷LAD中遠段血流情況見圖1、圖2。

Figure 1.Normal blood flow of coronary artery angiography before ballon occlusion.圖1 球囊封堵前的冠脈造影顯示血流正常

Figure 2.No blood flow of middle－distal segment in LAD by coronary artery angiography after ballon occlusion.圖2 球囊封堵后的冠脈造影LAD中遠段血流被球囊完全阻斷

2 ECG檢測

小型豬心肌梗死前后ECG變化見圖3、圖4。

Figure 3.Normal ECG of mini swine before ballon occlusion.圖3 球囊封堵前正常小型豬的ECG

Figure 4.STV1－V5drive up ECG of myocardial infarction in mini swine after ballon occlusion.圖4 球囊封堵后心肌梗死小型豬的ECG3UCG和ECT檢測

心肌梗死小型豬的心臟超聲和心肌核素顯像表現(xiàn)見圖5、圖 6。

Figure 5.Apex and septa were thin，movement was weak detected by UCG.圖5 UCG示心尖和室間隔變薄、運動減弱

Figure 6.Perfusion defect of apex and septa detected by SPECT圖6 ECT示心尖和室間隔核素灌注充盈缺損

4 病理改變

小型豬正常心肌和梗死心肌的病理變化，見圖7、8。

Figure 7.Normal myocardium tissue.圖7 正常心肌組織

Figure 8.Myocardial cell edema，profile illegibility and nucleus discharge of part cells were observed.圖8 心肌梗死后可見心肌細胞水腫，組織輪廓模糊，部分細胞核逸出胞質(zhì)

5 成功率及術(shù)中并發(fā)癥

20只豬均成功完成冠脈造影，經(jīng)皮球囊封堵法成功制備小型豬心肌梗死模型10只，均經(jīng)過ECG、UCG、ECT和病理證實，成功率50%。死亡10只，其中4只分別于球囊封堵過程中誘發(fā)心室纖顫死亡，2只封堵結(jié)束時球囊釋放過快，致再灌注心律失常出現(xiàn)心室纖顫死亡，1只因指引導(dǎo)管深插入冠脈開口內(nèi)，刺激冠狀動脈痙攣，誘發(fā)心室纖顫死亡。1只因麻醉過深至呼吸抑制死亡，1只因麻醉不佳豬躁動致指引導(dǎo)管穿破左冠狀竇急性心包填塞，心室纖顫死亡，1只疑肝素用量不足至冠脈內(nèi)血栓形成，血壓下降，心室纖顫死亡。

6 UCG檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)

與造模之前比，心梗后左室舒張末期內(nèi)徑(EDV)和左室收縮末期內(nèi)徑(ESV)顯著延長，左室射血分數(shù)(LVEF)和短軸縮短率(FS)顯著下降(P＜0.05)，室壁活動減弱。8周后，MSCs移植組均較移植前好轉(zhuǎn)(P＜0.05，P＜0.01)，而生理鹽水組亦有所改善，但無顯著差異;MSCs移植組的EDV和ESV較生理鹽水組明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)，MSCs移植組的LVEF和FS較生理鹽水組明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)，見表1，MSCs移植組的室壁活動較生理鹽水組好轉(zhuǎn)。

表1 超聲心動圖測定心功能的指標Table 1.Index of left ventricular function by UCG examination(.n=5)

表1 超聲心動圖測定心功能的指標Table 1.Index of left ventricular function by UCG examination(.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs baseline;△P ＜0.05;△△P ＜0.01 vs 1 week after myocardial infarction.

n LVEF(%)Baseline 82.75 ±6.43 82.34 ±5.951 week after myocardial infarction 63.06 ±4.89＊＊ 60.73 ±4.16＊＊8 weeks after myocardial infarction 68.63 ±5.62 78.98 ±5.86△EDV(mL)Baseline 45.68 ±5.86 43.93 ±5.421 week after myocardial infarction 67.53 ±8.94＊＊ 65.19 ±7.69＊＊8 weeks after myocardial infarction 69.86 ±7.64 46.31 ±6.18△△ESV(mL)Baseline 8.65 ±2.40 7.73 ±2.151 week after myocardial infarction 24.64 ±3.83＊＊ 25.62 ±4.74＊＊8 weeks after myocardial infarction 19.68 ±3.29 11.84 ±2.96△FS(%)Baseline 51.42 ±5.36 50.67 ±5.241 week after myocardial infarction 33.74 ±3.78＊＊ 32.85 ±3.41＊＊8 weeks after myocardial infarction 38.28 ±4.35 47.84 ±4.93△△

討 論

多年來動物心梗模型一直沿用開胸結(jié)扎法［4］，此法對動物創(chuàng)傷較大，術(shù)后難飼養(yǎng)，恢復(fù)慢，死亡率高［5］，隨著介入技術(shù)的飛速發(fā)展，使得經(jīng)皮球囊封堵術(shù)制備心梗模型變?yōu)榭赡?，本研究采用的是?jīng)皮球囊封堵術(shù)，它簡便易行，創(chuàng)傷小［6］;且相比較開胸結(jié)扎法，心梗相關(guān)血管還可以再利用，比如通過該血管注射藥物或?qū)⒐撬韪杉毎浦驳焦Ｋ绤^(qū)，進行更多領(lǐng)域的研究等。

西藏小型豬是我國目前已知小型豬中體重最輕的品種之一，是一種理想的實驗動物［7］。在解剖學方面，豬的心臟結(jié)構(gòu)及冠脈走行也與人有獨特的相似性。西藏小型豬與人類的血液生理指標及血液生化指標的比較，與其它實驗動物如犬、獼猴，差異是最小的。尤其是CHOL和TG指標與人類接近，可能更適合用于人類器官移植的供體、制作心血管方面的疾病動物模型等等。但是藏豬的紅細胞數(shù)和血紅蛋白偏高，可能與藏豬來自高原環(huán)境有關(guān)。血小板 PLT在(424.62±172.21)×109/L，高出人類正常值范圍，且有顯著差異。西藏小型豬的紅細胞壓積(HCT)高于人類且有顯著差異。這說明西藏小型豬的血液較黏稠，凝血功能較人類強。因此，在制備心梗模型時要特別注意加強抗凝治療，本文在開始造模時沒有特別注意這一點，結(jié)果有1只豬因冠脈廣泛血栓形成而導(dǎo)致死亡，在以后的造模過程中注意大劑量肝素抗凝和30 min追加肝素，就再也沒有發(fā)生血栓事件。

本文造模的成功率為50%，與孫帥等［8］報道的結(jié)果相似，死亡主要發(fā)生在造模初期，主要死于心室纖顫。待一切條件摸索成熟后，很少再出現(xiàn)動物死亡。在本實驗中，選取的小型豬體重在30－40 kg之間，方便操作，且動物有一定的耐受力。術(shù)前動物應(yīng)具備良好的一般生命體征，是實驗成功的前提條件。理想的動物生命體征包括心率平均為(110.96±29.37)beats/min，根據(jù)在實驗中的體會，應(yīng)維持術(shù)中心率小于110 beats/min、呼吸20 beats/min、血壓平均120/80 mm-Hg比較理想。

實驗的進行應(yīng)有良好的麻醉作為保障。在實驗初期，有1只豬麻醉效果不穩(wěn)定，術(shù)中肢體擺動，煩躁不安，體位固定不佳。在球囊封堵20 min時，血壓由156/120 mmHg迅速下降至20/20 mmHg，造影劑在冠脈開口處向四周擴散，心包穿刺出不凝血，術(shù)后尸檢發(fā)現(xiàn)在冠脈開口附近有一破裂口貫通主動脈管壁?？紤]為麻醉過淺，豬肢體擺動，指引導(dǎo)管刺破管壁，誘發(fā)急性心臟壓塞。另有1只因麻醉過深導(dǎo)致呼吸停止而死亡。本實驗中，麻醉采用的是地西泮、速眠新Ⅱ聯(lián)用戊巴比妥鈉生理鹽水溶液肌肉注射。速眠新注射液為氟哌啶醇、保定寧、新保靈、氯胺酮等藥物制成的復(fù)方制劑。具有中樞性鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和肌肉松弛作用，具有起效快特點。但由于麻醉維持時間短，常被用作大動物手術(shù)前誘導(dǎo)麻醉［9］。戊巴比妥鈉屬于巴比妥酸鈉的衍生物，屬于中效催眠藥，隨著劑量從小到大，依次會出現(xiàn)鎮(zhèn)靜、催眠和麻醉作用。該藥具有靜脈注射起效快、麻醉過程平穩(wěn)，維持時間較長，術(shù)后恢復(fù)快等特點，但其安全范圍較窄，對呼吸和循環(huán)系統(tǒng)有嚴重抑制，會出現(xiàn)血壓降低。聯(lián)合使用可以減少單獨使用每種藥物的劑量，進而降低藥物對動物的副作用，減少其在動物體內(nèi)因麻醉藥蓄積造成的麻醉意外［10］。行腹腔麻醉效果不佳，是由于腹腔注射后藥物在腹腔內(nèi)被腹水稀釋后再緩慢吸收，血液達到有效濃度的時間較長，靜脈麻醉又不易控制給藥速度，不易控制麻醉深度。小型豬肌肉注射藥物先彌散入肌肉組織再進入血液循環(huán)，可起到一定的緩沖作用，有利于麻醉深度的控制。耳后肌群松軟，神經(jīng)反射不敏感，更利于給藥和縮短誘導(dǎo)時間。術(shù)中每隔30 min－1 h追加初始劑量的1/3－1/4，有效維持麻醉。

實驗豬心臟與體重的比值接近人類。有左右2條冠狀動脈起自升主動脈根部，位于主動脈瓣上方。2條冠脈直徑相似，但與人相比，側(cè)枝循環(huán)較少。左冠狀動脈走行于肺動脈與左心耳之間，在到達錐旁室間溝前分為錐旁室間支和回旋支。前者發(fā)往心尖，類似于人類的左前降支LAD。它和右冠脈提供約80%的心肌血供。左冠脈分支供應(yīng)左心房、右心室、左心室、室間隔。豬的這些特殊的生理結(jié)構(gòu)使其在進行心臟導(dǎo)管介入和心肌內(nèi)注射實驗時易誘發(fā)心律失常、冠脈痙攣、血栓形成、心室纖顫、心臟停搏和猝死。在本實驗中，心室纖顫的發(fā)生率為45%，且一旦發(fā)生室顫，搶救成功很低。綜合室顫發(fā)生的原因，有以下幾個方面:首先，急性缺血后折返環(huán)形成、觸發(fā)活動、自律性升高構(gòu)成了室性心律失常的物質(zhì)基礎(chǔ)［11］。其次，相比其它動物種屬，豬本身室顫閾值較低，缺血后容易誘發(fā)室顫［12］。另外，與人類急性心梗發(fā)生在粥樣斑塊基礎(chǔ)上不同，模型動物冠狀動脈本身正常，球囊封堵后心肌細胞缺乏缺血預(yù)適應(yīng)過程，容易發(fā)生心律失常［13］。

因而在實驗中我們應(yīng)采取如下措施降低室顫的發(fā)生率及死亡率:(1)麻醉適當，既不能過淺，也不宜過深。(2)肝素用量宜大，且于造模術(shù)中定期追加，才能預(yù)防血栓形成。(3)球囊封堵位置不宜過高，由于豬的LAD支配范圍廣，而側(cè)枝循環(huán)少，高位阻斷會擴大心梗面積，超出豬的耐受能力。我們選用封堵點在左前降支第二對角支遠端，既可以達到滿意的實驗效果又可以保證存活率。(4)造模前和造模過程中，預(yù)防性靜脈給予利多卡因和胺碘酮，從而有效預(yù)防心律失常的發(fā)生。(5)造模開始時，適當延長預(yù)適應(yīng)時間和次數(shù)。(6)造模成功后，緩慢釋放球囊可明顯減少再灌注心律失常的發(fā)生。一旦發(fā)生惡性心律失常，則應(yīng)立即進行緊急處理。如出現(xiàn)室性早搏時，立即加大利多卡因和胺碘酮的用量。如出現(xiàn)室性心動過速，立即靜脈注射利多卡因和胺碘酮。對于心室顫動，立即給予360J體外除顫，胸外按壓，直至恢復(fù)竇性心律。經(jīng)過實驗前期的經(jīng)驗積累，實驗后期我們采用了以上預(yù)防措施，大大減少了室顫的發(fā)生率，提高了造模的成功率。

本文采用了造模成功的小型藏豬，觀察了MSCs經(jīng)冠脈移植對小型藏豬梗死心肌的療效，MSCs移植組和生理鹽水組的基線LVEF、FS、EDV、ESV均無顯著差異，2組造模1周的LVEF、FS均較造模前明顯降低(P＜0.01)，但2組比較無顯著差異(P＞0.05)。EDV、ESV均較造模前明顯增大(P＜0.01)，但2組比較無顯著差異(P＞0.05)，即2組小型藏豬的心梗模型具有可比性。MSCs移植組8周時LVEF、FS較心梗1周時明顯增加(P＜0.05)，EDV、ESV均較心梗1周時明顯減少(P＜0.01)，而生理鹽水組移植8周時LVEF、FS較心梗1周時有所增加，EDV、ESV均較心梗1周時有所減少，但均無顯著差異(P＞0.05)，心梗8周時MSCs移植組較生理鹽水組的 LVEF、FS明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)，EDV、ESV 明顯減少(P ＜0.05，P ＜0.01)，說明 MSCs移植治療心肌梗死是有效的，同時也進一步說明經(jīng)皮球囊封堵冠狀動脈法制備的小型豬心肌梗死模型適合進行骨髓干細胞移植的研究。

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