劉煜敏， 張 悅△，陸海英， 郝艷鵬， 陸敏

(上海中醫(yī)藥大學(xué)1科技實(shí)驗(yàn)中心，2護(hù)理學(xué)院，上海 201203)

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是從臨床常用的活血化瘀中藥丹參中提取的水溶性成分，整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Sal B 具有一定的抗肝、腎纖維化作用［1，2］，但其具體作用環(huán)節(jié)尚不清楚。在腎纖維化的腎小球部位，活化的系膜細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞。本研究以此作為切入點(diǎn)，觀察Sal B對活化系膜細(xì)胞的影響并結(jié)合腎纖維化中轉(zhuǎn)化生長因子－β(TGF－β)/Smad這一重要信號(hào)通路初步探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 藥品與試劑

Sal B購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111562－200807;重組人轉(zhuǎn)化生長因子1(transforming growth factor－ β1，TGF － β1)購自 Millipore;DMEM高糖培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone;α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)單抗購自Sigma;轉(zhuǎn)化生長因子Ⅰ型受體(TGF－β1receptorⅠ，TβRI)多抗、轉(zhuǎn)化生長因子Ⅱ型受體(TGF－β1receptorⅡ，TβRII)多抗購自Santa Cruz;磷酸化 Smad2單抗、Smad2單抗購自 Cell Signal;Smad7單抗購自R＆D;甘油醛－3－磷酸脫氫酶免疫球蛋白G偶聯(lián)辣根過氧化物酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase immunoglobulin G horse radish peroxidase，GAPDH IgG －HRP)單抗購自上?？党缮锕?預(yù)染蛋白標(biāo)記物購自Fermentas;二喹林甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光底物(Super SignalWestern Pico chemiluminescent substrate，ECL)試劑盒購自 Pierce。

2 方法

2.1 大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng) 具體步驟參照參考文獻(xiàn)［3］。乙醚麻醉饑餓過夜雄性大鼠(150 g左右)，無菌操作取腎皮質(zhì)，于Hank's液中洗滌后剪碎，過80目和150目篩網(wǎng)，下接200目篩網(wǎng)。用移液管從200目篩網(wǎng)上吸取腎小球，轉(zhuǎn)移到試管中。試管垂直靜置10－15 min使腎小球自然下沉后棄上清。加入IV型膠原酶，37℃消化20 min后棄上清。加入培養(yǎng)液10 mL，懸浮腎小球，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3－4 d內(nèi)勿觸動(dòng)培養(yǎng)瓶，此后每周換液2次，待80% －90%細(xì)胞融合后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 蛋白免疫印跡分析 用上樣緩沖液裂解6孔板細(xì)胞，收集后煮沸變性10 min。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate － polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE)后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含5%脫脂奶粉的Tris緩沖溶液(Tris buffer solution，TBS)室溫封閉1 h，然后分別加入 α －SMA 抗體(1∶3000)、TβRI抗體(1∶200)、TβRII抗體(1∶400)、p － Smad2(1∶1000)抗體、Smad2(1∶1000)抗體、Smad7 抗體(1∶1000)、GAPDH抗體(1∶5000)，4℃孵育過夜。洗膜后再用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的 IgGⅡ抗(1∶5000)雜交，室溫孵育1 h。再次洗膜后用ECL試劑顯色并曝光成像。利用圖像分析系統(tǒng)掃描確定X光片上的雜交條帶的吸光度值。

2.3 細(xì)胞免疫熒光染色 細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板內(nèi)無菌處理的蓋玻片上，各組干預(yù)結(jié)束，再用預(yù)冷PBS洗2遍后，再用預(yù)冷4%多聚甲醛固定10 min。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗2遍后用含0.5% 小牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS室溫封閉30 min，Ⅰ抗4℃孵育過夜，PBS洗3遍后用Alex 536抗小鼠熒光Ⅱ抗室溫標(biāo)記1 h，PBS洗3遍后用含4’，6－二脒基 －2－苯基吲哚(4’，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI)的封片劑封片，避光自然干燥后熒光顯微鏡(Nikon E600FN)觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Sal B對系膜細(xì)胞活化的影響

Figure 1.Effect of Sal B on α － SMA expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF － β1group;C:10－5 mol/L Sal B group;D:10－6mol/L Sal B group;E:TGF－β1+10－5mol/L Sal B group;F:TGF－β1+10 －6mol/L Sal B group.圖1 Sal B對系膜細(xì)胞α－SMA表達(dá)的影響

α－SMA蛋白明顯表達(dá)和系膜細(xì)胞胞體增大是系膜細(xì)胞活化的重要標(biāo)志。圖1顯示，TGF－β1刺激系膜細(xì)胞24 h即可見顯著表達(dá)α－SMA及胞體增大表現(xiàn)，提示TGF－β1成功誘導(dǎo)系膜細(xì)胞活化。而在10－5mol/L和10－6mol/L Sal B組及其與 TGF－β1共刺激組均未見系膜細(xì)胞活化表現(xiàn)。

2 TGF－β1刺激系膜細(xì)胞活化對Smad2磷酸化及Smad7蛋白表達(dá)的影響

由圖2可見，隨TGF－β1刺激時(shí)間延長，Smad2分子呈現(xiàn)明顯磷酸化活化。與對照組比較，TGF－β1刺激系膜細(xì)胞 15 min、30 min、60 min、120 min、360 min均可見 Smad2顯著磷酸化(P＜0.05)。總Smad2和Smad7蛋白表達(dá)在TGF－β1刺激各時(shí)點(diǎn)未見明顯變化(P＞0.05)。

Figure 2.Effects of treatment for different time of 5 μg/L TGF －β1on Smad2 phosphorylation，Smad2 and Smad7 protein expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF－β115min group;C:TGF－β130min group;D:TGF－β160min group;E:TGF－β1 120min group;F:TGF－β1360min group..n=4.*P ＜0.05 vs control group.圖2 TGF－β1刺激不同時(shí)點(diǎn)對系膜細(xì)胞Smad2磷酸化、Smad2、Smad7表達(dá)的影響

3 Sal B對系膜細(xì)胞TGF－β1兩型受體及Smad2磷酸化的影響

由圖3可知，TGF－β1刺激組TβRI表達(dá)(0.784±0.110)、TβRII表達(dá)(0.576 ±0.085)分別高于對照組(0.501±0.125)、(0.074±0.033)，且組間比較差異顯著(P＜0.05)。而Sal B可顯著抑制TGF－β1刺激引起的此兩型受體表達(dá)增多。由圖3可知，TGF－β1刺激后可引起系膜細(xì)胞Smad2顯著磷酸化(P＜0.05);而Sal B可抑制這種效應(yīng)。但TGF－β1刺激和Sal B干預(yù)對于系膜細(xì)胞中Smad2分子的蛋白表達(dá)均未見顯著影響。

Figure 3.Effects of Sal B on TGF－β1receptors and Smad2 expression in mesangial cells.A:control group;B:TGF － β1group;C:10－5mol/L Sal B group;D:10－6mol/L Sal B group;E:TGF － β1+10－5mol/L Sal B group;F:TGF － β1+10－6mol/L Sal B group..n=6.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs TGF－β1group.圖3 Sal B對活化系膜細(xì)胞TβRI、TβRII、Smad2磷酸化及Smad2表達(dá)的影響

討 論

作為腎小球內(nèi)的主要細(xì)胞類型之一，系膜細(xì)胞在維持基膜的更新與修復(fù)、調(diào)節(jié)腎小球血流量、支持毛細(xì)血管壁等方面發(fā)揮重要作用。包括TGF－β1和胰島素［4］在內(nèi)的許多細(xì)胞因子以及高糖、高脂［5，6］等刺激都能調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞由休眠向基質(zhì)過度產(chǎn)生的活化狀態(tài)的表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生。系膜細(xì)胞的活化是以α－SMA表達(dá)誘導(dǎo)和基質(zhì)過度產(chǎn)生為特點(diǎn)的［7］。在腎臟中，高親和力的TGF－β受體主要在小球上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)和系膜細(xì)胞表達(dá)［8］。

腎小球系膜細(xì)胞活化是腎小球腎炎、糖尿病腎病、腎纖維化等多種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的共性事件。因此，抑制系膜細(xì)胞活化的研究也是治療這些腎臟病的一個(gè)切入點(diǎn)。Wang等［9］發(fā)現(xiàn)在系膜細(xì)胞中骨形成蛋白7(bone morphed protein，BMP－7)具有與TGF－β1相反的作用，主要是通過調(diào)控TGF－β/Smad通路實(shí)現(xiàn)的，不需要 Erk1/2、p38或JNK等信號(hào)參與。Dai等［10］研究表明在系膜細(xì)胞中，肝細(xì)胞生長因子能夠穩(wěn)定Smad轉(zhuǎn)錄共抑制子TGIF而特異性拮抗TGF－β1的促纖維化效應(yīng)。

近年來對于小分子物質(zhì)Sal B(分子量718)的藥理作用研究也不僅僅局限于其抗氧化作用。不斷有研究表明，Sal B對多種細(xì)胞在遭受刺激或損傷時(shí)均具有一定的保護(hù)作用。在神經(jīng)細(xì)胞缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧的損傷過程中，Sal B能夠維持鈣穩(wěn)態(tài)，提高基質(zhì)金屬蛋白酶，降低細(xì)胞凋亡率［11］。Liu 等［12］的研究表明Sal B通過調(diào)控PI3K/Akt/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路保護(hù)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的凋亡。在系膜細(xì)胞中，Sal B能抑制呈劑量依賴性高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)沉積，其作用機(jī)制是通過抑制NF－κB激活調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和金屬基質(zhì)蛋白酶活性而實(shí)現(xiàn)的［13］。

本研究首先對TGF－β1刺激系膜細(xì)胞后其表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白α－SMA的表達(dá)做一檢測，免疫熒光觀察結(jié)果與蛋白免疫印跡分析結(jié)果一致提示Sal B對TGF－β1刺激引起的系膜細(xì)胞活化有拮抗作用。然后分別檢測了TGF－β1激活系膜細(xì)胞后對Smad通路的受體型和抑制型Smad分子的影響，結(jié)果提示Smad2明顯磷酸化而活化，總Smad2和Smad7表達(dá)無顯著變化。隨后，本研究對Sal B抑制系膜細(xì)胞活化的機(jī)制做一簡單探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Sal B能夠抑制TGF－β1兩型受體表達(dá)和Smad2磷酸化活化。此前也已有體外實(shí)驗(yàn)表明一些小分子天然產(chǎn)物，如姜黃素，具有拮抗腎臟細(xì)胞TGF－β1兩型受體表達(dá)從而減少細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積的作用［14］。

綜上所述，在TGF－β1刺激系膜細(xì)胞活化的病理過程中，Sal B能夠抑制 TβRI、TβRII表達(dá)，抑制TGF－β/Smad信號(hào)通路激活，拮抗系膜細(xì)胞活化。Sal B對系膜細(xì)胞內(nèi)源性的TGF－β1兩型受體蛋白表達(dá)和Smad2磷酸化的抑制作用可能是其發(fā)揮抗腎纖維化作用的細(xì)胞學(xué)靶標(biāo)之一。

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