遲小華，楊 波，張 峰，盧學(xué)春，劉麗宏，代漢仁（.解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥劑科，北京 00800；.解放軍總醫(yī)院南樓血液科，北京 0085；.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所，北京 0009）

異甘草酸鎂（magnesium isoglycyrrhizinate）是天然甘草酸的立體異構(gòu)體鎂鹽，具有抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗氧化等多種功效。肝臟是血液腫瘤放化療時(shí)最容易受到影響的器官，肝臟毒性也常常是限制放化療劑量和治療方案得以順利實(shí)施的重要因素。因此，對(duì)于血液腫瘤患者化放療期間加強(qiáng)保肝治療非常必要。然而，在白血病化療期間應(yīng)用異甘草酸鎂保肝治療的同時(shí)是否對(duì)白血病細(xì)胞也具有保護(hù)作用目前尚不清楚。有研究表明，甘草酸及其衍生物對(duì)多種類型的實(shí)體腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，還可能具有逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的作用[1-3]。目前，有關(guān)異甘草酸鎂對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)將不同濃度的異甘草酸鎂作用于人慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞系，觀察其對(duì)白血病細(xì)胞增殖的抑制作用，為臨床治療白血病合并肝損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

自動(dòng)酶標(biāo)儀（CHROMATE4300酶標(biāo)儀，陜西展鵬科技有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（RCO-3000TVBB型，美國(guó)RECO）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（加拿大BIOFIL公司）；96孔板（上海Sunub科技發(fā)展公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；微量移液器（法國(guó)Pipetman公司）；電子天平（德國(guó)賽多利斯）。

異甘草酸鎂（正大天晴制藥有限公司，純度98.5%，批號(hào)091231）：粉狀白色結(jié)晶。RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；10%胎牛血清（杭州四季青公司）；CCK-8檢測(cè)試劑盒（上海日本同仁化學(xué)研究所）。

1.2 細(xì)胞

人慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株由解放軍總醫(yī)院基礎(chǔ)所免疫室韓為東博士惠贈(zèng)。

1.3 K562細(xì)胞培養(yǎng)

將K562細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～4 d換液傳代1次。

1.4 CCK-8法測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105～1×106·mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，12 h后加入異甘草酸鎂，實(shí)驗(yàn)組異甘草酸鎂采用無(wú)血清1640培養(yǎng)液稀釋，貯存濃度為20 g·L-1，終稀釋濃度分別為10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6g·L-1；對(duì)照組加與最高濃度組等量的RPMI 1640培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，分別孵育24，48，72 h。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并攝像。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每孔加入5 mg·mL-1的CCK-8 10 μL，繼續(xù)孵育2 h，置酶標(biāo)儀上用450 nm和630 nm雙波長(zhǎng)測(cè)吸光度值（OD值）。檢測(cè)的 OD值大小與活細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)，以O(shè)D值為縱軸，作用時(shí)間為橫軸，繪制細(xì)胞增殖曲線。取24 h的OD值比較各組的細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算公式如下：

細(xì)胞增殖抑制率（%） = （1－實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察異甘草酸鎂對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用

藥物處理第1～3天后，鏡下觀察10 g·L-1給藥組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑，細(xì)胞數(shù)量減少；其余各藥物濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與對(duì)照組無(wú)明顯差異（圖1）。

圖1 不同濃度異甘草酸鎂作用下培養(yǎng)48 h K562細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)①對(duì)照組；②10 g·L-1組；③1 g·L-1組；④1×10-1 g·L-1組；⑤1×10-2 g·L-1組；⑥1×10-3 g·L-1組；⑦1×10-4 g·L-1組；⑧1×10-5 g·L-1組；⑨1×10-6 g·L-1組Fig 1 Microscopic observation of K562 cell growth 48 hours after treatment with different concentrations magnesium isoglycyrrhizinate①the control group; ②10 g·L-1 group; ③1 g·L-1 group; ④1×10-1 g·L-1 group; ⑤1×10-2 g·L-1 group; ⑥1×10-3 g·L-1 group; ⑦1×10-4 g·L-1 group; ⑧1×10-5 g·L-1 group; ⑨1×10-6 g·L-1 group

2.2 異甘草酸鎂抑制K562細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)曲線及抑制率

不同濃度的異甘草酸鎂作用于K562細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并且具有時(shí)間和濃度依賴性。接種后的細(xì)胞在48 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10 g·L-1藥物濃度作用24，48和72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為44.9%，65.9%，86.4%。異甘草酸鎂作用48 h后IC50約為1.6 g·L-1（見(jiàn)圖2、表1）。

圖2 不同濃度異甘草酸鎂作用K562細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig 2 Growth curves of K562 cells after treatment with magnesium isoglycyrrhizinate at different concentrations

3 討論

異甘草酸鎂是從甘草中提取的甘草酸堿催化異構(gòu)化后成鹽精制而得。研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸通過(guò)作用于激素受體，影響離子通道等機(jī)制，不但具有類腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，還具有抗炎、減輕免疫病理反應(yīng)的作用，臨床上已用于治療藥物性和病毒性肝炎[4-8]。對(duì)于血液腫瘤患者而言，化放療期間同時(shí)加強(qiáng)保肝治療已成為降低化放療相關(guān)肝毒性的重要策略。異甘草酸鎂在保護(hù)肝細(xì)胞的同時(shí)是否對(duì)白血病細(xì)胞的增殖也具有促進(jìn)作用尚不明確。

表1 異甘草酸鎂作用K562細(xì)胞48 h的生長(zhǎng)抑制率.n = 3Tab 1 Inhibitory rate of K562 cells 48 hours after treatment with magnesium isoglycyrrhizinate.n = 3

本研究結(jié)果表明，異甘草酸鎂對(duì)人慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞系的增殖具有抑制作用；在濃度為10-2g·L-1以上時(shí)抑制作用更顯著（抑制率＞ 30%），并呈劑量、時(shí)間依賴性；48 h的半數(shù)抑制濃度為1.6 g·L-1，這與文獻(xiàn)報(bào)道的甘草酸及其類似物（甘草黃酮、甘草次酸）在較高濃度時(shí)才具有顯著抑瘤作用的結(jié)果類似[9-10]。以異甘草酸鎂臨床常用劑量計(jì)算，體內(nèi)藥效學(xué)濃度與體外抑制白血病細(xì)胞增殖的濃度相近（1×10-3～1×10-2g·L-1），而此劑量范圍對(duì)于正常造血功能恢復(fù)無(wú)影響。此外，我們利用生物信息學(xué)方法分析了異甘草酸鎂對(duì)人類基因表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因7條，下調(diào)基因22條（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），并初步預(yù)測(cè)出異甘草酸鎂可能具有去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑曲古抑菌素樣的作用，這有可能是它抑制白血病細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。本研究為異甘草酸鎂預(yù)防和治療白血病化療相關(guān)肝損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。異甘草酸鎂抗白血病的確切機(jī)制以及是否與化療藥物具有協(xié)同抗白血病作用仍有待于深入研究。

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