王曉娟，袁 君，陳 艷，岳一濤

（安徽省淮南市第一人民醫(yī)院，安徽 淮南 232007）

苯巴比妥（phenobarbital，PB）、苯妥英（phenytoin，PT）、卡馬西平（carbamazepine，CBZ）都是臨床常用的抗癲癇藥，常聯(lián)合應用?；颊叩乃幋鷦恿W因個體差異有所不同，且不同廠家、不同劑型的產品吸收率及生物利用度也有顯著差異，僅憑經驗用藥難以達到理想的治療效果[1]，臨床主張個體化給藥。因此，筆者建立了一種簡便、快速、準確的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，以艾司唑侖為內標，同時測定3種藥物的血藥濃度?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

島津LG-10ATVP高效液相色譜儀，配SPD-10AVP紫外檢測器，N2000色譜工作站；湘儀L600型離心沉淀機，光學讀數(shù)分析天平（湘儀天平儀器廠）；恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；旋渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）；D1810C型自動雙重純水蒸餾器（上海申勝生物技術有限公司）。苯妥英鈉對照品（批號為100210-200401），卡馬西平對照品（批號為100142-199503），苯巴比妥對照品（批號為171222-200504），艾司唑侖對照品（批號為1219-0102），均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈、乙醚為色譜純（美國Tedia公司）；自制重蒸餾水；正常人空白混合血清（本院檢驗科提供）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：大連依利特C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇 -乙腈 -水 （27.5∶27.5 ∶45）；柱溫：30 ℃；檢測波長：243 nm；流速：0.8 mL/min；內標物：艾司唑侖；定量環(huán)進樣：20μL。空白血清、含藥血清經本法處理后的色譜圖見圖1?？梢姡琍B，PT，CBZ及艾司唑侖的保留時間分別為 5.282，7.607，8.340，10.973 min。分離度 R均大于1.5，各色譜峰無重疊、峰形好。地西泮、氨茶堿等其他同服藥物同法提取、進樣后對結果無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 標準貯備液及內標液制備

精密稱取105℃恒重的PB，PT，CBZ及艾司唑侖對照品適量，分別置25 mL量瓶中，以甲醇稀釋為1000.0，299.8，266.0，534.0μg/mL的標準貯備液及內標液，4℃冷藏保存。

2.3 樣品處理

精密吸取艾司唑侖內標液5μL（534.0μg/mL），用N2小心揮干；精確吸取血清200μL，置15 mL具塞尖底玻璃試管中，充分溶解，加5 mL乙醚旋渦振搖3 min，以4000 r/min轉速離心5 min，取上清液，置10 mL尖底玻璃離心管中，于45℃水浴、氮氣吹干。殘渣用100μL流動相溶解，取20μL進樣。

2.4 血藥濃度測定方法

精確配制含 PB，PT，CBZ 分別為 20.00，14.99，6.65μg/mL 的正常人血清對照品溶液（同時精密加入艾司唑侖內標液5μL），按2.3項下方法處理后進樣分析，以此作為定量標準。結果按公式C= （Ai/A內i）/（As/A內s）·Cs計算，式中 Ai和 A內i分別為樣品和內標峰面積，As和 A內s分別為對照品和內標峰面積，Cs為對照品質量濃度。

2.5 方法學考察

標準曲線制備：取2.2項下配制的各藥物標準貯備液，精密配制成含 PB 為 80.0，40.0，20.0，10.0，5.0，2.5，1.5μg/mL，含 PT為 59.96，29.98，14.99，7.49，3.75，1.87，1.12μg/mL，含 CBZ 為26.60，13.30，6.65，3.32，1.66，0.83，0.50μg/mL 的血清標準液，各7管。按2.3項下方法及色譜條件處理后進樣測定。以各藥物峰面積與內標峰面積之比（X）對各藥血清濃度（Y）進行線性回歸。結果見表1。

表1 各藥物直線方程與線性范圍

萃取回收率試驗：取空白血清200μL，準確加入一定量的標準貯備液，配成高、中、低3種質量濃度的血清標準品，并按2.3項下方法處理后進樣，以此峰面積與未經提取的相同量對照品峰面積之比計算各藥的萃取回收率。結果見表2。

表2 萃取回收率試驗結果（，n=3）

表2 萃取回收率試驗結果（，n=3）

藥物PB藥物質量濃度（μg/mL） 對照品595287297331145211414293204440102284952507476280238095峰面積 萃取回收率（%）RSD（%）PT CBZ 40.020.010.044.9722.4511.2413.306.653.32血樣583381±12834291087±6986136208±2316398964±11570196058±627499011±2772925837±19442470565±8941234762±539998.097.997.896.395.996.897.298.898.62.22.41.72.93.22.82.11.92.3

方法回收率及精密度試驗：取萃取回收率試驗項下低、中、高系列質量濃度的標準質控血清樣品，按2.3項下方法操作，以當日回歸方程計算各藥物質量濃度，以加入質量濃度與實測質量濃度之比計算相對回收率。取上述低、中、高3種質量濃度的標準質控血清樣品，分別在同日內測定3次和連續(xù)3 d每天測定1次，計算日內精密度和日間精密度。結果見表3。

表3 方法回收率及精密度試驗結果（，n=3）

表3 方法回收率及精密度試驗結果（，n=3）

藥物 實測質量濃度（μg/mL）加入質量濃度（μg/mL）精密度RSD（%）方法回收率（%）PB PT CBZ 40.0020.0010.0044.9722.4511.2413.306.653.3238.90±1.1019.63±0.629.81±0.2443.94±1.7222.00±0.8910.99±0.4013.19±0.436.60±0.213.27±0.1097.398.098.097.798.097.899.299.298.5日內2.83.22.43.94.03.63.33.23.0日間3.22.63.13.54.23.92.82.23.4

最低檢測質量濃度確定：按信噪比 S/N=3∶1計算，測得PB，PT，CBZ的最低檢測質量濃度分別為1.0，0.5，0.2μg/mL。

2.6 臨床應用

采用本法測定了以治療藥物監(jiān)測及中毒監(jiān)測為目的的80例癲癇患者的血藥濃度，均在血藥濃度達到穩(wěn)態(tài)后于早上服藥前空腹采血進行檢測。其中有的患者經劑量調整后，效果明顯。典型病例如劉某，女，21歲，癲癇史8余年，聯(lián)合口服應用苯妥英鈉及丙戊酸鈉，因出現(xiàn)口齒不清、眼球震顫、共濟失調等癥狀，初步判斷為苯妥英鈉中毒，監(jiān)測血藥濃度苯妥英鈉為11.8μg/mL，丙戊酸鈉為55.3μg/mL。分析認為，丙戊酸鈉可抑制苯妥英鈉的代謝，且競爭蛋白結合，兩藥同服時苯妥英鈉的游離藥物代謝減少，可能出現(xiàn)苯妥英鈉總質量濃度在有效質量濃度范圍內，但游離藥物質量濃度卻較高，導致了中毒癥狀。將口服苯妥英鈉0.15 g、每日2次調整為0.1 g、每日2次后，癥狀逐漸緩解，于7 d后重新測定，苯妥英鈉血藥濃度為8.5μg/mL。出院隨訪，患者病情穩(wěn)定。

3 討論

筆者曾參照文獻[2]采用甲醇 -乙腈 -水（45∶10∶45）進行試驗，結果峰形不好、回收率低。重新調整三者比例為甲醇-乙腈-水（27.5∶27.5∶45）后，峰形理想、分離效果好、柱效高、回收率均在96%以上，整個過程15 min即可完成。經反復試驗發(fā)現(xiàn)，選用乙醚作萃取溶劑時，雜質峰少，回收率高，一次萃取即可，且乙醚毒性低、揮發(fā)快、易于分離。此方法可以滿足快速、準確地檢測血藥濃度的要求。初步試驗顯示，該方法同樣適用于地西泮、阿普唑侖及氯硝西泮的血藥濃度測定。臨床治療癲癇聯(lián)合應用PT，PB，CBZ比較常見[3]，但三者很少聯(lián)用艾司唑侖，因此，可采用艾司唑侖為內標物同時測定3種藥物的血藥濃度。

筆者曾參照文獻[4]選用254 nm作檢測波長，發(fā)現(xiàn)在此波長處PT吸收小。反復試驗表明，3種藥物在243 nm波長處吸收均最強。色譜圖中僅見CBZ吸收峰，未見其活性代謝物（ECBZ）吸收峰，空白血樣中雜質對藥物及內標峰也無干擾。

為保證檢測的血藥濃度數(shù)據(jù)對臨床用藥有實際指導意義，合適的取樣時間是關鍵。在實驗室開展血藥濃度監(jiān)測初期，常有采血時間不當?shù)默F(xiàn)象。若臨床懷疑中毒，應測定服藥后峰濃度或出現(xiàn)中毒癥狀時采血為宜，療效不佳時應測定谷濃度。此外，還應注意藥物的峰濃度與藥物劑型、給藥途徑等因素有關。因此，解釋血藥濃度結果時應注意給藥途徑、末次給藥時間和取血時間等相關因素。

血藥濃度監(jiān)測和臨床觀察很好地結合起來，才會使癲癇患者的藥物治療更安全、有效。由于患者個體差異或年齡、性別以及生理、病理等因素的差別，藥物的血漿蛋白結合率有較大的差異，這對PT的影響更復雜。蛋白結合率低可使患者總的血藥濃度在正常范圍內，但游離藥物濃度可能已超過了上限，而藥物的療效和中樞性毒性反應與血液中游離狀態(tài)的藥物濃度密切相關，這在解釋血藥濃度監(jiān)測結果時應特別注意。

[1]唐 薇，楊春梅，江秀華，等.216例癲癇患者卡馬西平血藥濃度監(jiān)測與合理用藥[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析，2001，1（2）：104-105.

[2]涂厲標，祝永明.HPLC法同時測定人血清中苯巴比妥、苯妥英和卡馬西平的濃度[J]. 中國藥師，2005，8（11）：934-936.

[3]唐榮福，于 星.抗癲癇藥物聯(lián)合使用時血藥濃度分析[J].醫(yī)藥導報，2007，26（2）：163-164.

[4]王增壽，朱光輝，李光乾.高效液相色譜法測定血清中苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平與氯硝安定的濃度[J].中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2002，19（2）：155-156.