席超 劉進(jìn)

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，北京100875）

組織切片技術(shù)是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域中的重要技術(shù)，主要有石蠟切片、震動(dòng)切片和冰凍切片等技術(shù)。其中冰凍切片技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其優(yōu)點(diǎn)就是快速、便捷，且能較完整的保存抗原活性，如細(xì)胞的某些抗原成分，特別細(xì)胞膜抗原，受體抗原，酶及肽類(lèi)抗原在石蠟切片的處理過(guò)程中，不可避免的受到破壞或失去抗原活性，而且對(duì)于原位分子雜交等核酸探針雜交實(shí)驗(yàn)，冰凍切片技術(shù)也成為首選切片技術(shù)。冰凍切片機(jī)的應(yīng)用也相應(yīng)的越來(lái)越廣泛，本文以Leica CM3050S為例，探討了如何更好的使用和維護(hù)冰凍切片機(jī)，為科研和臨床更好的服務(wù)。

Leica CM3050S具有電動(dòng)和手動(dòng)切片功能，可實(shí)現(xiàn)3種自動(dòng)切片模式，速度可調(diào)，厚度范圍0.5-300μm；還具有自動(dòng)修塊功能，厚度范圍：5-150μm；冷凍室溫度范圍0℃至-40℃，具有獨(dú)立的樣本制冷系統(tǒng)，樣本頭制冷溫度-10℃至-50℃。

1 儀器操作

1.1 儀器的操作系統(tǒng)主要由總開(kāi)關(guān)、操縱面板1、操縱面板2、手輪和冷凍箱組成?？傞_(kāi)關(guān)控制儀器的供電，儀器開(kāi)機(jī)運(yùn)行后，無(wú)特殊原因不要關(guān)閉總開(kāi)關(guān)，若由于斷電或其他原因關(guān)閉總電源后，則必須要對(duì)冷凍箱及其附件進(jìn)行除菌和干燥處理后才能重新啟動(dòng)儀器。

1.2 操縱面板1主要控制冷凍箱照明、溫度、除霜、時(shí)間設(shè)定等功能，并顯示切片厚度、切片模式等信息。

溫度調(diào)節(jié)包括箱體溫度（CT）和樣品頭溫度（OT），OT溫度設(shè)定可比CT略高。不同的組織選用不同的溫度進(jìn)行切片，過(guò)高或過(guò)低的溫度均會(huì)影響切片的質(zhì)量，表1中是一些常用組織的參考切片溫度，具體采用的溫度還需操作者在實(shí)踐中進(jìn)行摸索。除霜是冰凍切片機(jī)每天均需進(jìn)行的操作，用于除去儀器運(yùn)行過(guò)程中，箱體內(nèi)部產(chǎn)生的霜。Leica CM3050S具有三種除霜模式：箱體自動(dòng)除霜、箱體手動(dòng)除霜和樣品頭手動(dòng)除霜模式。箱體自動(dòng)除霜每24小時(shí)自動(dòng)進(jìn)行一次，具體時(shí)間可以人為設(shè)定（最好設(shè)定在00:00左右），除霜結(jié)束后儀器自動(dòng)降溫到設(shè)定值。自動(dòng)除霜時(shí)程的默認(rèn)設(shè)置是8分鐘，如果儀器長(zhǎng)時(shí)間使用后，除霜8分鐘無(wú)法使箱體完全解凍，可以通過(guò)增加除霜時(shí)程來(lái)解決。箱體手動(dòng)除霜和樣品頭手動(dòng)除霜模式可以通過(guò)選擇手動(dòng)除霜鍵來(lái)進(jìn)行（一般不使用）。

1.3 操縱面板2主要控制電動(dòng)切片、樣品頭升降、切片厚度和修片厚度。

電動(dòng)切片有三種模式：間歇模式、連續(xù)模式和單次模式。電動(dòng)切片速度可以手動(dòng)調(diào)節(jié)，電動(dòng)切片的開(kāi)啟和中斷可以手控或者通過(guò)腳踏板控制。樣品頭升降主要用來(lái)調(diào)節(jié)樣品和刀片之間的距離，具有粗調(diào)和細(xì)調(diào)兩種模式。

1.4 儀器使用后的操作。日常使用后需進(jìn)行一些處理：將OT設(shè)為0℃，CT設(shè)為-10℃,這樣既可以延長(zhǎng)壓縮機(jī)的壽命又利于除霜過(guò)程的進(jìn)行；取出刀片并進(jìn)行除菌、干燥以備下次使用；清除箱體中的切片廢棄物；取出未使用的組織樣本另行保存；鎖定手輪和控制面板1。長(zhǎng)時(shí)間不使用儀器可以將總開(kāi)關(guān)關(guān)閉，但箱體和所有有關(guān)切片的附件均需進(jìn)行除菌和干燥處理。

1.5 包埋劑的使用。包埋劑主要用于將組織與樣品臺(tái)固定在一起，并包被組織以利于展片。包埋劑可選用常見(jiàn)的生理鹽水或PBS等緩沖液，近年來(lái)一種混合型包埋劑OCT，使用的越來(lái)越廣泛，OCT包埋后，組織切片更加平整。OCT是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，可以直接用于組織包被，也可以對(duì)組織進(jìn)行切片預(yù)處理后再切片。預(yù)處理方法：組織浸蔗糖后放入蔗糖與OCT 1:1體積比的混合液中，室溫2小時(shí)；放入OCT中室溫4小時(shí)（具體時(shí)間視組織大小而定）。

2 儀器保養(yǎng)：

冰凍切片機(jī)的日常保養(yǎng)主要包括除菌、清潔、更換熒光燈管等工作。

儀器的除菌有多種方法，一些文獻(xiàn)中也介紹了一些除菌方法，如：熏蒸法：取甲醛、高錳酸鉀、水相混合，進(jìn)行氧化消毒；噴霧法：用過(guò)氧化氫噴霧；擦拭法：用戊二醛或乙醇擦拭物品表面[1]。但是用這些方法除菌后，需關(guān)閉儀器并將箱體和所有附件充分干燥后才能重新使用，這就對(duì)儀器的正常使用帶來(lái)一定的影響。這里推薦一種方法，可以在-20℃時(shí)，即不關(guān)閉儀器的情況下進(jìn)行消毒作業(yè)，從而不影響使用者的正常使用。1) 將溫度設(shè)為-20℃或更高；2) 從箱體中移走標(biāo)本組織并妥善儲(chǔ)存；3) 小心將刀片從刀架上取下；4) 將切片廢棄物清出；5)Leica cryofect (50%-100%乙醇+0.1%-0.25%葡萄糖酸氯已定)噴灑在箱體和附件表面，持續(xù)約15min；6) 用紙巾擦干箱體和附件表面的液體；7) 將溫度重新設(shè)定為需要溫度正常使用。

儀器的清潔主要包括儀器表面、玻璃窗、冷卻系統(tǒng)的進(jìn)風(fēng)口和出風(fēng)口以及儀器背板的散熱口。清潔方式可以用乙醇或水進(jìn)行擦拭。

更換熒光燈管時(shí)，需先將玻璃窗取下，燈管安裝在防眩罩后面，更換完燈管后再將玻璃窗裝上，更換燈管時(shí)不需關(guān)閉儀器，但要盡量快速操作，以避免箱體結(jié)霜。

3 錯(cuò)誤信息：

Leica CM3050S具有自檢功能，當(dāng)儀器出現(xiàn)功能異常時(shí)會(huì)顯示一些錯(cuò)誤信息。1) “POWER FAILURE”：儀器斷電后重新啟動(dòng)即會(huì)顯示此信息，幾秒后會(huì)自動(dòng)消失；2) “?”：樣品頭升降功能異常，檢查樣品頭升降電纜插頭是否正確連接；3) “#”：溫度探頭損壞或發(fā)生局部短路；4) “DRY MICROTOME”: 儀器斷電重新啟動(dòng)后可能出現(xiàn)此信息，若出現(xiàn)此信息不要馬上開(kāi)機(jī)，待箱體和附件均需充分干燥后才可重新開(kāi)機(jī)[2]。

4 常見(jiàn)問(wèn)題、原因及解決方法：

制作高質(zhì)量的組織切片，需要在長(zhǎng)期的練習(xí)、實(shí)踐中摸索經(jīng)驗(yàn)，表2中總結(jié)了在使用此儀器時(shí)出現(xiàn)的常見(jiàn)問(wèn)題、產(chǎn)生原因及解決方法。

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[1]王關(guān)娥，王紅，舒清明，丁紅，楊傳輝，冰凍切片機(jī)的消毒與保養(yǎng)，中華醫(yī)院感染學(xué)雜志2008,18(6):876。

[2]Leica, CM3050S Instruction manual, 2008, V1.3.