Ying Jiang XU, Xiu Hui TIAN, Xiu Zhen ZHANG, Xiang Hong GONG,Shi Juan ZHANG, Hui Hui LIU, Li Min ZHANG

激素，諸如雄激素(AS)、雌激素(ES)和孕激素(PS)等，在生命體中扮演了非常重要的角色。AS是主要的男性類固醇激素，是決定在胚胎發(fā)育過程和青春期性成熟過程當(dāng)中男性特征顯現(xiàn)的首要決定因素，通常用于恢復(fù)肌肉形狀和力量的治療中[1]。眾所周知，雌激素直接影響大腦中控制情緒和認(rèn)知的區(qū)域[2]。目前，很多廣泛使用的避孕藥物當(dāng)中都含有乙炔基雌二醇，其作為一種活性成分與PS相結(jié)合。雌激素與孕激素的結(jié)合也通常被用于治療更年期綜合征[3]。

濫用藥物會(huì)對水產(chǎn)品產(chǎn)生非常不利的影響。激素可以促進(jìn)動(dòng)物的性別差異，減短動(dòng)物的生長周期[4－6]。雙酚A可以導(dǎo)致劍尾魚的細(xì)胞凋亡，雄性鳉魚在產(chǎn)卵期前接觸水中的雙酚A會(huì)增加魚卵的死亡率[7]。二乙烯基雌酚會(huì)對海中鯉魚類的甲狀腺系統(tǒng)如垂體、甲狀腺組織和脫碘酶產(chǎn)生一系列的破壞作用[8]。幾種已知的激素經(jīng)常被添加到水產(chǎn)品中來提高養(yǎng)殖效率。激素比較穩(wěn)定而且不易降解，當(dāng)通過食物鏈進(jìn)入人體后，仍具有很強(qiáng)的生物活性和潛在的致癌性，容易引發(fā)中性肥胖、免疫缺陷和骨質(zhì)疏松等疾病[9,10]。

目前有很多方法可進(jìn)行動(dòng)物組織中激素的監(jiān)控和檢測。通常這些方法可以分為兩類。1)免疫學(xué)方法：基于抗原-抗體的特異性相互作用產(chǎn)生的高選擇性，但因天然抗體的穩(wěn)定性較差，所以該方法應(yīng)用范圍較窄，并且很容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[11,12]。2)色譜方法：最常用的激素檢測方法包括HPLC[13,14]，LCMS[15,16]，GC-MS[17,18]等。然而這些方法也有一些相應(yīng)的缺點(diǎn)。HPLC通常只能采用常規(guī)方法，而不能進(jìn)行特殊的檢測。GC-MS需要在色譜分離之前進(jìn)行衍生化，因?yàn)槎鄶?shù)組分本身具有熱不穩(wěn)定性、非揮發(fā)性或者極性等特征。然而，衍生化過程使得樣品處理步驟變得復(fù)雜而費(fèi)時(shí)，并且會(huì)造成目標(biāo)類固醇的損失或者降解。

UltraPerformance LC?(UPLC?)(Waters Corp.,Milford, MA)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-ESI-MSMS)具有高的分離效率和鑒定準(zhǔn)確率，目前已經(jīng)成為分析測定激素的首選方法[19－24]。本文作者發(fā)展了一種同時(shí)測定水產(chǎn)品中24種激素的方法，并對樣品處理方法和儀器分析條件進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化后得到了較為滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

去乙酰環(huán)丙氯地孕酮醋酸鹽和乙羥基二降孕甾烯炔酮購自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)。4-n-辛基苯酚購自Supelco (Bellefonte, PA)。雙酚A、4-壬基苯酚、二乙烯基雌酚、雌激素酮、17α-乙炔基雌二醇，17β-雌二醇、雌三醇、甲地孕酮醋酸鹽、三氨乙基胺、炔諾酮醋酸鹽、脫水羥基孕酮、孕酮、赤霉烯酮、己雌酚、氯化孕酮醋酸鹽、睪丸激素、勃地酮、19-去甲睪酮、甲睪酮、去氫孕酮和雙烯雌酚均購自Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany)。甲醇、甲基叔丁基醚和乙腈均為色譜純級別，購自Tedia(Fairfield, OH)。水為去離子超純水。實(shí)驗(yàn)中用到的其他試劑均為分析純。

1.2 儲(chǔ)存溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)備

所有組分的儲(chǔ)存溶液濃度均用色譜純的甲醇配制為100 μ g/mL并保存在－20 ℃。標(biāo)準(zhǔn)溶液是將所有組分混合并用甲醇稀釋。在分析過程中使用的溶液均為所有組分的儲(chǔ)存溶液在分析當(dāng)日進(jìn)行混合稀釋而成。24個(gè)組分(100 μg/mL) 的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 24種激素的總離子流色譜圖。每種激素對應(yīng)的保留時(shí)間為：雌三醇(2.63 min)，三氨乙基胺(3.98 min)，勃地酮(4.14 min)，諾龍(4.29 min)，雙酚A (4.15 min)，赤霉烯酮(4.36 min)，17β-雌二醇(4.38 min)，睪丸激素(4.58 min)，17α-乙炔基雌二醇(4.74 min)，己雌酚(4.88 min)，甲睪酮(4.91 min)，脫水羥基孕酮(4.98 min)，二乙烯基雌酚(5.13 min)，雙烯雌酚(5.24 min)，雌激素酮(5.25 min)，左旋-18-甲基炔諾孕酮(5.36 min)，去氫孕酮(5.73 min)，去乙酰環(huán)丙氯地孕酮醋酸鹽(6.09 min)，甲地孕酮醋酸鹽(6.15 min)，孕酮(6.22 min)，炔諾酮醋酸鹽(6.23 min)，氯化孕酮醋酸鹽(6.28 min)，4-n-辛基苯酚(7.93 min)，4-壬基苯酚(8.08 min)。

1.3 樣品的預(yù)處理和純化

樣品(5 g)在20 mL的乙酸乙酯中勻漿30 s，同時(shí)加入3 mL 10%的碳酸鈉溶液，然后在室溫下超聲10 min。勻漿在7000 r/min下離心10 min。將上層清液在40 ℃下蒸干，然后重溶于10 mL甲醇/水(1:9, v/v)備用。

固相萃取(SPE)過程使用一根Waters HLB柱進(jìn)行，其步驟如下：1)使用5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇進(jìn)行活化(活化速度均為3 mL/min)；2)以1.2 mL/min的速度將10 mL樣品灌入SPE柱；3)使用5 mL甲醇/水(2:8, v/v)沖洗，然后真空干燥5 min；4)用10mL甲醇進(jìn)行洗脫。洗脫液在溫和的氮?dú)鈿饬飨?0 ℃蒸干后，重溶于1 mL乙腈/超純水(1:1, v/v)，然后使用0.22 μm注射過濾器將液體注入自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中。

1.4 UPLC-ESI-MS-MS條件

UPLC-ESI-MS-MS系統(tǒng)主要包括一個(gè)Waters ACQUITY? UPLC系統(tǒng)與Quattro Premier tandem mass spectrometer(Waters)在線連接。實(shí)驗(yàn)中所用的色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm × 100 mm,1.7 μ m)，柱溫40 ℃。ACQUITY流動(dòng)相分別為A(乙腈)與B(水)。在進(jìn)樣(10 μL)后，線性梯度為8 min內(nèi)從20:80 A-B到95:5 A-B，然后保持2 min。然后，A的濃度減少到20%，保持2 min。整個(gè)分析時(shí)間為12 min，其中包括2 min恢復(fù)至初始流動(dòng)相條件的平衡時(shí)間。在整個(gè)的色譜分離過程中，流速設(shè)定為0.25 mL/min，分析柱的柱溫為40 ℃。色譜流出組分被電噴霧離子化后在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下進(jìn)行檢測。AS和PS在離子化過程中形成正離子，而ES則會(huì)形成負(fù)離子。為滿足這一需求，MS的極性轉(zhuǎn)換器的開關(guān)將按照被分析目標(biāo)的性質(zhì)而分時(shí)段轉(zhuǎn)換。干燥氮?dú)饬魉贋?00 L/h，溫度為350 ℃。碰撞氣體(Ar)流速為0.12 mL/min，毛細(xì)管電壓為2850 V，停留時(shí)間設(shè)定為100 ms。

1.5 確認(rèn)程序

校準(zhǔn)曲線和QC樣品在連續(xù)的3個(gè)工作日內(nèi)進(jìn)行分析。由被分析物峰面積對表觀濃度函數(shù)制得校準(zhǔn)曲線的線性通過最小二乘法計(jì)算，線性相關(guān)系數(shù)在實(shí)驗(yàn)中計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS-MS的優(yōu)化

每一份調(diào)節(jié)溶液均采用直接注入(10 μ L/min)方式引入電噴霧離子源。MS和MS-MS中產(chǎn)生的主要離子分別在正離子和負(fù)離子的模式下進(jìn)行鑒定。為了提高檢測靈敏度，收集診斷碎片離子并且對所有的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。表1和表2為所有類固醇的母離子和子離子最適宜條件的MS-MS參數(shù)：隔離母離子的第一個(gè)四極桿電壓以及使其有效碎裂的碰撞能量。在作者的研究當(dāng)中，2個(gè)子離子被監(jiān)測。該實(shí)驗(yàn)參照歐洲聯(lián)合會(huì)(EU)有關(guān)鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其離子化目標(biāo)組分的分子當(dāng)中2個(gè)MRM轉(zhuǎn)換在數(shù)值范圍內(nèi)給出了4個(gè)點(diǎn)，而一個(gè)數(shù)值足以作為準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中，也對通常使用的流動(dòng)相條件如甲醇/水和乙腈/水體系進(jìn)行了優(yōu)化。從溶劑消耗和離子響應(yīng)方面考慮，甲醇并不是一個(gè)較好的選擇。

表1 ESI+模式下13種激素的UPLC-ESI-MS-MS分析參數(shù)＊應(yīng)用于定量的離子。

表2 ESI-模式下11種激素的UPLC-ESI-MS-MS分析參數(shù)＊應(yīng)用于定量的離子。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是使用LC-MS-MS進(jìn)行生物樣品(如水產(chǎn)樣品)中藥物檢測時(shí)出現(xiàn)的一個(gè)特有現(xiàn)象。從水產(chǎn)樣品中與被分析物一起萃取出來的雜質(zhì)，如果與被分析物在LC柱中共洗脫，就可能在電噴霧處對待分析物的離子化起到抑制或者增強(qiáng)作用?；|(zhì)效應(yīng)會(huì)降低分析的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。因此，在本研究中利用LC-MS-MS系統(tǒng)分別對采用附加的清洗步驟前后的樣品抽提物進(jìn)行了分析，通過對結(jié)果進(jìn)行比較的方式對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果表明，多數(shù)目標(biāo)組分的檢出限(LODs)在進(jìn)行SPE清洗后比未經(jīng)清洗的對照組低1個(gè)數(shù)量級。

2.3 選擇性和重復(fù)性

水產(chǎn)品當(dāng)中激素的鑒定是通過每個(gè)組分的保留時(shí)間和2個(gè)離子的變化來進(jìn)行。特別指出的是，一個(gè)給定的分析物中2個(gè)主要子離子的相對強(qiáng)度是獨(dú)特的，在測試的濃度范圍內(nèi)幾乎不會(huì)隨著濃度的變化而改變，因此可以藉此確定樣品當(dāng)中某種被分析物的存在。離子強(qiáng)度變化在20%以內(nèi)通常認(rèn)為是可以接受的。

2.4 定量限和線性

通過采用外標(biāo)法6個(gè)點(diǎn)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量分析，質(zhì)量濃度范圍為1～50 ng/L。該曲線通過繪制分析物峰面積的比率得到。在特定濃度范圍內(nèi)可以得到非常好的線性，所有鑒定樣品的相關(guān)系數(shù)在0.983到0.991之間。該標(biāo)準(zhǔn)曲線適用于日內(nèi)和日間檢驗(yàn)和穩(wěn)定性測試過程樣品中所有組分的定量。24種激素的定量限(LOQs)在0.3～1.0 μg/kg之間。

2.5 精密度和準(zhǔn)確性

日內(nèi)和日間的準(zhǔn)確性和精密度通過在不同天中的3次分析得到。每次分析均在相同QC濃度下平行重復(fù)6次。QC樣品的日內(nèi)和日間分析的精密度值(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差) 分別為4.5%～8.8%和7.9%～10.8%。該方法顯示其準(zhǔn)確度在16%以內(nèi)。這些數(shù)據(jù)在生物分析鑒定當(dāng)中屬于可接受的范圍。

2.6 穩(wěn)定性

初步研究結(jié)果表明在該研究使用的實(shí)驗(yàn)條件下激素是比較穩(wěn)定的。對冷凍-解凍過程、連續(xù)進(jìn)樣和長期穩(wěn)定性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果比較滿意。當(dāng)樣品置于室溫40 h、84 h內(nèi)3次冷凍-解凍過程以及樣品在－20 ℃條件下冷凍30 d的條件下，被分析物仍然保持穩(wěn)定。通過在10 ℃條件下自動(dòng)進(jìn)樣器中放置30 h來對樣品處理過程中的穩(wěn)定性進(jìn)行測試，在這一過程中，待測激素并未發(fā)生降解，其回收率在76.4%～89.3%之間。在基質(zhì)中待測激素起始濃度平均為76%左右可以被認(rèn)為是穩(wěn)定的。

2.7 分析方法應(yīng)用

對從當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I的實(shí)際樣品采用上述方法進(jìn)行檢測。在60份樣品中，雙酚A在其中20份樣品中被檢測到，其質(zhì)量濃度范圍在0.5～6.2 μg/kg之間。雙酚A因其具有導(dǎo)致動(dòng)物內(nèi)分泌失調(diào)的潛在活性[25,26]已經(jīng)成為一種在環(huán)境研究中眾所周知的目標(biāo)分子。小蝦樣品的總離子流色譜圖和離子色譜圖如圖2所示。其2個(gè)轉(zhuǎn)換離子也在監(jiān)測范圍之中。所有離子保留時(shí)間和色譜峰面積比與標(biāo)準(zhǔn)值相比，均滿足EU分析標(biāo)準(zhǔn)[27－29]。

圖2 樣品前處理方法和儀器分析條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化后小蝦樣品的總離子流色譜圖和離子色譜圖。

3 結(jié)論

本文建立的鑒定和定量水產(chǎn)樣品中激素的分析方法檢出限可達(dá)μg/kg級水平。與傳統(tǒng)的液相色譜相比，UPLC運(yùn)行時(shí)間短，每個(gè)樣品分析只需要12 min，這使得所建立的方法對激素分析更具吸引力。該方法被證明具有很好的靈敏度、線性、精密度和準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于水產(chǎn)品中的激素檢測。

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