韓依辰, 殷玉和, 孫 博, 劉新濤, 吳叢梅*

(1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012;2.長春百克藥業(yè),吉林長春 130021)

0 引 言

IL-24(白細(xì)胞介素-24)具有免疫調(diào)節(jié)作用。研究證實,IL-24基因可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)旁觀者抗腫瘤效應(yīng)[1],誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時,對正常組織卻沒有損傷,是一種理想的腫瘤治療基因[2-4]。研究發(fā)現(xiàn),重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-24能高效表達(dá)白細(xì)胞介素-24,以此質(zhì)粒作為載體導(dǎo)入靶細(xì)胞進(jìn)行腫瘤基因治療有較廣闊的應(yīng)用前景。因此,探索大規(guī)模制備、純化質(zhì)粒DNA的工藝即成為重要的研究任務(wù)。

然而,在大腸桿菌細(xì)胞溶解產(chǎn)物中,質(zhì)粒DNA僅僅占全部核酸的2%(w/w),大量存在的RNA和蛋白質(zhì)必須在后續(xù)步驟中除去。由于DNA難于與RNA有效分離,在制備質(zhì)粒DNA時,不得不引入外源RNA酶A(RNaseA)以去除RNA雜質(zhì),這就使得最終產(chǎn)品存在一定的安全隱患[5]。為克服質(zhì)粒DNA制備過程中有毒化學(xué)物質(zhì)和動物源性酶類污染及雜質(zhì)去除不徹底等缺陷,本研究探討了質(zhì)粒DNA的純化方法,即利用異丙醇和LiCl沉淀法初步去除大分子RNA和蛋白,然后,以DEAE Sepharose FF離子交換層析法去除染色體DNA、小分子RNA、蛋白質(zhì)等關(guān)鍵雜質(zhì),并對最終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測,為大規(guī)模制備基因治療用質(zhì)粒DNA奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

pcDNA3.1-IL-24質(zhì)粒由吳叢梅博士構(gòu)建[6],含有氨芐青霉素抗性基因為篩選標(biāo)記基因,大小為7.6 kb。大腸桿菌E.coli DH5α由吉林大學(xué)疫苗中心保存。

1.2 試劑及儀器

胰蛋白胨、酵母提取物;

陰離子交換層析柱填料DEAE Sepharose FF,購自美國GE公司;

BCA蛋白檢測試劑盒,購自Pierce公司;

多功能自控發(fā)酵罐為New Brunswick Scientific公司BIOFLO 5000 40 L發(fā)酵罐;

核酸蛋白檢測儀,購自美國Pharmacia公司;酶標(biāo)儀,購自Beckman公司。

1.3 細(xì)菌發(fā)酵

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。將質(zhì)粒pcDNA3.1-IL-24轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞[8]。挑取單個菌落,接種4 mL M9培養(yǎng)液,過夜培養(yǎng)后接種2 L M9培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h,作為發(fā)酵菌種。發(fā)酵菌種接種發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(蛋白胨2 g/L,酵母提取物5 g/L,K2HPO47 g/L,Na2HPO46 g/L,(NH4)2SO42 g/L,葡萄糖5 g/L,硫酸鎂2 g/L,Amp 100 μ g/mL)后,按20 L發(fā)酵規(guī)模于37℃培養(yǎng),6 h后流加4 L補(bǔ)充培養(yǎng)基(葡萄糖100 g/L,酵母提取物20 g/L,干酪素10 g/L,Amp 100 μ g/mL),繼續(xù)培至溶氧值迅速上升。16 h結(jié)束發(fā)酵,離心收集菌體,稱重后保存于-20℃。

1.4 堿性裂解提取質(zhì)粒

取640 g發(fā)酵菌體,重懸于5 L溶液Ⅰ(50 mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl,10 mmol/L EDTA,pH值為8.0)中,充分混勻,冰浴10 min。隨即緩緩加入5 L溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH,2%SDS),溫和混勻后,冰浴5 min。然后立即加入5 L冰預(yù)冷的溶液Ⅲ(3 mol/L乙酸鉀),充分混勻,冰浴30 min。加入5 L CaCl2(2 mol/L),冰浴2 h。4層滅菌紗布過濾,離心(4 000 r/min,30 min),得到澄清裂解液。

1.5 質(zhì)粒DNA粗純

將澄清裂解液中加入0.6倍體積異丙醇,室溫放置30 min,12 000 r/min,離心30 min,收集沉淀,重懸于150 mL TE溶液中,待沉淀完全溶解,加入等體積5 mol/L冰預(yù)冷的LiCl,混勻后,室溫放置30 min,12 000 r/min,離心30 min。取上清液,加入等體積異丙醇,混勻,室溫放置1 h,室溫下,12 000 r/min,離心10 min。

1.6 DEAE Sepharose FF離子交換柱精純質(zhì)粒DNA

將色譜填料DEAE Sepharose FF按產(chǎn)品說明填裝到色譜柱中,用流動相Ⅰ(0.5 mol KAc,pH值為5.5)平衡色譜柱,含有質(zhì)粒DNA的樣品上柱后,再用流動相Ⅰ平衡,然后分別用流動相Ⅱ(0.3 mol NaC1,25 mmol Tris,10 mmol EDTA,pH值為8.0)、流動相Ⅲ(0.5 mol NaC1,25 mmol Tris,10 mmol EDTA,pH值為8.0)洗脫,流速為40 mL/min,分別收集洗脫峰進(jìn)行檢測,流動相Ⅳ(2 mol NaCl,0.5 mol NaOH)在位清洗。

1.7 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量評價

1.7.1 殘留蛋白質(zhì)檢測

用BCA蛋白檢測試劑盒檢測樣品中蛋白質(zhì)濃度。100 μ L樣品與100 μ L BCA試劑反應(yīng),37℃水浴放置30 min,檢測其在562 nm處的吸收值。

1.7.2 DNA純度檢測

采用分光光度法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量,在260 nm和280 nm兩個波長下讀數(shù)。在260 nm的讀數(shù)用于計算樣品中的DNA濃度,即1OD260=50 μ g雙鏈DNA;根據(jù)260 nm和280 nm讀數(shù)的比值(OD260/OD280)估算DNA的純度。

1.7.3 抗生素殘留試驗

抗生素檢定培養(yǎng)基按說明書制備。陽性對照為氨芐青霉素,以生理鹽水為陰性對照。不銹鋼管(內(nèi)徑0.5 cm,高1 cm)內(nèi)裝液體200 μ L。將已過夜活化的枯草桿菌用無菌水稀釋,混勻,均勻涂布到抗生素檢定培養(yǎng)基平板上,放平,凝固。在上述測定板上均勻放置不銹鋼管,分別加入陽性對照氨芐青霉素200 μ L,生理鹽水、待測質(zhì)粒各200 μ L。標(biāo)號后,38℃下培養(yǎng)24 h,觀察抑菌圈情況并拍照。

2 實驗結(jié)果

2.1 質(zhì)粒DNA精純

EAE Sepharose FF純化pcDNA3.1-IL-24色譜圖如圖1所示。

圖1 DEAE Sepharose FF純化pcDNA3.1-IL-24色譜圖

從洗脫曲線及電泳結(jié)果可見,NaCl濃度為0.3 mol/L時,RNA被洗脫下來,見圖1中“RNA”峰。NaCl濃度為0.5 mol/L時,出現(xiàn)質(zhì)粒DNA洗脫峰,見圖1中“plasmid”峰。

經(jīng)DEAE Sepharose FF離子交換色譜純化后,RNA被有效去除,電泳未檢測到RNA殘留,如圖2所示。

1.RNA洗脫峰;2.質(zhì)粒原樣;3.DNA洗脫峰;4.Marker

2.2 質(zhì)粒DNA中殘留蛋白質(zhì)檢測

BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 質(zhì)粒DNA的BCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

其相關(guān)系數(shù)R2為0.997,具有較好的直線性相關(guān)性。檢測結(jié)果顯示,精純后雜質(zhì)蛋白的含量為0.007 μ g/mL質(zhì)粒DNA,說明本純化工藝能有效去除質(zhì)粒DNA中的蛋白雜質(zhì)。

2.3 質(zhì)粒DNA的濃度和純度

采用分光光度法對生產(chǎn)的質(zhì)粒DNA定量,質(zhì)粒DNA濃度為727 μ g/mL,A260/A280值為1.87,制備的質(zhì)粒DNA具有較高的純度。

2.4 質(zhì)粒DNA抗生素殘留檢查

觀察抑菌圈情況并拍照,結(jié)果如圖4所示。

測定板上陽性對照氨芐青霉素孔可見明顯的抑菌圈,而生理鹽水和質(zhì)粒DNA樣品孔無抑菌圈,即無抗生素殘留。

圖4 質(zhì)粒DNA抗生素檢測圖

3 討 論

下游工藝中純化質(zhì)粒DNA的經(jīng)典方法是氯化銫-溴化乙錠梯度離心法。此方法過程復(fù)雜,耗時長,且使用了有毒物質(zhì)溴化乙錠,就安全性而言,不適用于藥用級質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)。除此方法外,還有各具特色的質(zhì)粒純化試劑盒可供選擇,這些商業(yè)試劑盒純化效果好,卻因為價格昂貴不能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。在本工藝中,先通過高鹽沉淀來去除大分子RNA、蛋白質(zhì)、宿主DNA聚凝物,再通過離子交換色譜進(jìn)行質(zhì)粒純化,可有效去除內(nèi)毒素等主要雜質(zhì)[9-10]。

考慮到經(jīng)濟(jì)合理性和產(chǎn)品安全性,本工藝生產(chǎn)流程避免使用有毒試劑(苯酚、氯仿)和動物源性酶類(RNA酶),確保了產(chǎn)品的安全性的同時,也減少了檢測有毒試劑殘余量的繁瑣步驟;本工藝大量使用的國產(chǎn)試劑價格低廉,材料和設(shè)備可以再生使用。生產(chǎn)周期較短,具有良好的經(jīng)濟(jì)性,可以滿足實際生產(chǎn)需求;此外,本工藝操作簡單、易于放大、重復(fù)性好,并且建立了相應(yīng)的質(zhì)粒DNA質(zhì)量檢測體系,對于藥用級質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備具有重要的現(xiàn)實意義,也為同類研究奠定了理論基礎(chǔ),為進(jìn)一步的工業(yè)化生產(chǎn)提供了借鑒。

[1] Fisher PB.Is mda-7/IL-24 a“Magic Bullet”for cancer[J].Cancer Res.,2005,65(22):10128-10138.

[2] Su Z Z,Lebedeva I V,Sarkar D,et al.Ionizing radiation enhances therapeutic activity of mda-7/IL-24:overcomingradiation-and mda-7/IL-24-resistance in prostate cancer cells overexpressing the antiapoptotic proteins bcl-xL or bcl-2[J].Oncogene,2006,25:2339-2348.

[3] Madireddi M T,Su Z Z,Young C S,et al.Mda-7,a novel melanoma differentiation associated gene with promise for cancer gene therapy[J].Adv.Exp.Med.Biol.,2000,465:239-261.

[4] Saito Y,Miyahara R,Gopalan B,et al.Selective induction of cell cycle arrest and apoptosis in human prostate cancer cells through adenoviral transfer of the melanoma differentiation-associated-7(mda-7)/interleukin-24(IL-24)gene[J].Cancer.Gene.T-her.,2005,12:238-247.

[5] Tan P H,Chan C L,George A J.Strategies to improve non-viral vectors-potential applications in clinical transplantation[J].Expert.Opin.Biol.Ther.,2006,6(6):619-630.

[6] 劉永哲,吳叢梅,倪冠英,等.IL-24基因聯(lián)合電離輻射對前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2008,34:171-174.

[7] 李 霄,金寧一,米志強(qiáng),等.聯(lián)合應(yīng)用凋亡素基因新城疫病毒HN基因及IL-18基因?qū)谏亓龅囊种菩?yīng)研究[J].高技術(shù)通訊,2005,14(12):33-36.

[8] 薩姆布魯克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,黎孟楓,譯.2版.北京:科學(xué)出版社,1992:26-99.

[9] 蔣國潤,周東霞,孫 明,等.層析技術(shù)純化核酸疫苗[J].中國生物制品學(xué)雜志,2007,20(2):129-132.

[10] 皮文輝,孫從建,宋志強(qiáng),等.質(zhì)粒DNA的陰離子交換色譜法純化及內(nèi)毒素去除[J].色譜,2007,25(6):809-813.