孟斐

SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatases, PTPase)中的一員。SHP-2是由PTPN11基因所編碼的一種蛋白酪氨酸磷酸酶，它廣泛表達于哺乳動物機體的各種組織和細胞中，在胚胎發(fā)育、血細胞生成及多種生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中起到了重要的作用。許多研究表明SHP-2的突變與多種人類腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。近年來關(guān)于SHP-2在免疫反應(yīng)過程中的調(diào)節(jié)作用逐漸受到重視，許多研究證實了其與免疫反應(yīng)相關(guān)的細胞因子及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的密切關(guān)系。SHP-2在患者血液中的表達情況還不為我們所知，SHP-2在患者血液中參與宮頸癌發(fā)生的免疫機制仍然不清楚。本研究擬探討SHP-2與CD4+T在患者血液中的表達情況及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：人淋巴細胞分離液(天津灝洋)；Rabbit SH-PTP2(C-18)(Santa Cruz)；monoclonal mouse Anti-GAPDH(KANG CHEN)；Goat Anti-Mouse/Rabbit IgG-HRP二抗(康為試劑)；ECL蛋白發(fā)光試劑盒(Pierce)；紅細胞裂解液和Mouse Anti-Human CD4(北京四正柏)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本選擇 選擇沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院2007年6月～2010年1月婦產(chǎn)科住院患者進入本研究。45例宮頸癌(Ⅰ～Ⅲ期)患者，年齡從30歲到70歲，平均年齡48歲。32例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者(Ⅰ～Ⅱ)，年齡從30歲到60歲，平均年齡42歲。14例正常宮頸患者，年齡從30歲到62歲，平均年齡45歲。取材前均未接受任何治療。宮頸組織診斷在奉天醫(yī)院病理科。

1.2.2 Ficoll分層液分離人外周血淋巴細胞 取上述三組患者的新鮮抗凝血2ml，與生理鹽水1：1混勻后，小心加于2ml的淋巴細胞分離液之液面上，以1500轉(zhuǎn)/分離心(室溫平轉(zhuǎn)，半徑15cm)15分鐘，離心管中由上至下細胞分四層。取第二層細胞，加入到含4～5ml生理鹽水的試管中充分混勻后以3000轉(zhuǎn)/分離心(室溫平轉(zhuǎn)，半徑15cm)25分鐘，取沉淀，去上清。再重復(fù)上述步驟一次。收起沉淀加入到1.5ml EP中，再加1ml生理鹽水，混勻后以12000g/min離心15分鐘，4℃。取沉淀，去上清，于-70℃冰箱保存，標記。

1.2.3 Western blot方法檢測人外周血淋巴細胞中SHP-2蛋白的表達 收集Ficoll分層液分離獲得的人外周血單個核細胞，分別進行如下操作：細胞的裂解、蛋白質(zhì)定量(Bradford法)、蛋白樣品制備及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交、ECL反應(yīng)。

1.2.4 流式細胞儀檢測人外周血CD4+T的表達 取100ul人抗凝外周血加入5ml流式管底；10ul CD4+抗體加入流式管底與全血混勻，室溫避光孵育20分鐘；加入2ml 1×紅細胞裂解液混勻后避光放置10分鐘，溶解紅細胞；將樣品管1500rpm離心10分鐘，棄上清；加入2ml PBS洗液重懸細胞，1500rpm離心10分鐘，棄上清；加入0.5ml PBS洗液重懸細胞后流式細胞儀檢測。

2 統(tǒng)計分析

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。SHP-2及CD+T在子宮頸癌，CIN及正常宮頸患者血中的表達差異用方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 SHP-2蛋白在宮頸癌、CIN、正常宮頸患者外周血的表達結(jié)果 由western blot影像可以看出正常宮頸患者蛋白的條帶顯影淺，CIN患者蛋白的條帶顯影加深，而宮頸癌患者蛋白的條帶顯影非常深。提示SHP-2在宮頸癌組高表達，(圖1所示)。

圖1 SHP-2蛋白在宮頸癌、CIN、正常宮頸患者外周血的表達

表1 SHP-2蛋白在不同患者血中的表達結(jié)果

表2 CD4+T在不同患者血中的表達結(jié)果

通過統(tǒng)計學(xué)分析可知：宮頸癌組與正常宮頸組間有顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q＝4.331,p＜0.05)；宮頸癌組與CIN組間有顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q＝3.602,p＜0.05)；CIN組與正常宮頸組間無顯著差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q＝0.431,p＞0.05)。

3.2 CD4+T在宮頸癌、CIN、正常宮頸患者外周血的表達結(jié)果 CD4+T在宮頸癌組低表達，通過統(tǒng)計學(xué)分析可知：宮頸癌組與正常宮頸組間有顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q＝7.927,p＜0.05)；宮頸癌組與CIN組間有顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q＝6.712,p＜0.05)；CIN組與正常宮頸組間無顯著差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q＝1.397,p＞0.05)。

4 討論

T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的一大細胞群。T細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)在殺傷腫瘤細胞、控制腫瘤生長中起重要作用，T細胞有兩個亞群,分別表達CD4+和CD8+，CD4+細胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,且有重要的記憶功能,協(xié)調(diào)B細胞分化產(chǎn)生抗體。近年來SHP-2在免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用逐漸受到重視，SHP-2在T細胞中的生物學(xué)作用通過轉(zhuǎn)基因老鼠實驗得到證實，這些研究證實SHP-2負調(diào)控T細胞的激活，同時也調(diào)控T細胞的生物學(xué)活性。以前的研究顯示SHP-2是TCR信號傳導(dǎo)通路中的負調(diào)控因子[1]，在缺失GAB2的老鼠TCR介導(dǎo)的T細胞增殖被加強，在這個過程中SHP-2發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用[2-3]。由本實驗結(jié)果可知：血液中SHP-2的表達在宮頸癌組明顯高于CIN組與正常宮頸組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CIN組與正常宮頸組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。血液中CD4+T的表達在宮頸癌組明顯低于CIN組與正常宮頸組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CIN組與正常宮頸組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這表明隨著宮頸病情從良性到惡性的轉(zhuǎn)變，血液中SHP-2表達的值升高，同時伴隨著血液中CD4+T的降低。這也從患者血液水平證實了前面所陳述的推斷。惡性腫瘤的發(fā)生機制涉及很多方面，免疫機制是目前研究的新熱點?？梢哉J為，免疫系統(tǒng)激活后，易感個體和有抗性個體開啟了免疫系統(tǒng)中不同的基因或者是同種基因的表達產(chǎn)生了差異而造成了結(jié)局不同[4-6]。我們的實驗結(jié)果證實宮頸癌患者SHP-2高表達的同時CD4+T低表達，從免疫機制解釋了宮頸癌發(fā)生的機理。安華章等[7]發(fā)現(xiàn)：SHP-2是免疫系統(tǒng)的“剎車蛋白”，它在免疫反應(yīng)中起負向調(diào)控作用。這一發(fā)現(xiàn)為免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)機制增添了新的認識，同時提示“SHP-2”有可能成為免疫治療的新靶點。隨著科研的深入，此類天然“剎車”可“人工制造”，無疑將在免疫治療中發(fā)揮巨大作用。

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