彭 濤，滕軍放，關(guān)文娟，文全慶，張博愛，賈延劼

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州450052

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚層來源的具有多向分化能力的干細(xì)胞，具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌細(xì)胞、干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和造血細(xì)胞等多向分化和自我更新的能力，在體內(nèi)及體外一定條件下可橫向分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞［1］。Rho/Rho激酶(ROCK)信號通路是體內(nèi)重要的信號通路，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白骨架的聚合狀態(tài)而扮演著“分子開關(guān)”的角色，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的合成、降解、移動和收縮等，對細(xì)胞的分裂、收縮、黏附、遷移及分泌等活動具有重要的調(diào)節(jié)作用［2-3］。作者觀察了ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾體外誘導(dǎo)大鼠骨髓MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的效果，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:成年Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量150～200 g，雌雄不拘，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑:高糖 DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司，鹽酸法舒地爾注射液由天津紅日藥業(yè)股份有限公司提供，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF200)與膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)兔抗大鼠多克隆抗體及兔抗大鼠Cy3免疫熒光染色試劑盒均購自Santa Cruz公司，其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)、純化及擴增 取Wistar雄性大鼠，頸椎脫臼處死后，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡5 min，無菌條件下分離大鼠兩側(cè)股骨和脛骨，暴露骨髓腔，以含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，3 000 r/min離心2 min，棄上清液，以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以1×105mL－1的細(xì)胞密度接種于25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h半量換液。待貼壁細(xì)胞完全融合后，以含1 mmol/L EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，按1×104mL－1的密度接種，每隔48 h半量換液。倒置顯微鏡動態(tài)觀察骨髓MSCs的生長情況。傳至15代后備用。

1.3 骨髓MSCs的誘導(dǎo)分化 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選用200 μmol/L鹽酸法舒地爾誘導(dǎo)骨髓MSCs。取15～18代的骨髓MSCs，以2×104mL－1的密度接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70% ～80%時，用含終濃度200 μmol/L鹽酸法舒地爾的高糖DMEM液誘導(dǎo)。設(shè)4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下動態(tài)觀察誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)30、60、90、120及180 min細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5 細(xì)胞存活率測定 吖啶橙(AO)與溴化乙錠(EB)分別用PBS溶解成100 mg/L的工作液，使用前按體積比1∶1混勻。誘導(dǎo)30、60、90、120及180 min，分別加入AO-EB混和液。熒光顯微鏡下(×100)隨機計數(shù)5個非重疊視野，計算細(xì)胞存活率。

1.6 NSE、NF200與 GFAP的檢測 40 g/L多聚甲醛固定誘導(dǎo)后60、90、120及180 min的細(xì)胞，4℃過夜，TBST洗滌3次。用含體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白的TBST封閉60 min。去除封閉液，分別滴加一抗NSE、NF200與GFAP兔抗大鼠多克隆抗體，工作濃度均1∶100，4℃過夜后洗滌。加入Cy3標(biāo)記的二抗作用1 h，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察，隨機計數(shù)5個非重疊視野(×200)，計算NSE、NF200和GFAP陽性細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng)和純化 接種后24～48 h，骨髓細(xì)胞出現(xiàn)紡錘形改變，開始貼壁生長，隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細(xì)胞明顯增多并分裂增殖。7～10 d細(xì)胞胞體膨大，伸出長短不一、粗細(xì)不均多種形態(tài)的突起，細(xì)胞呈團簇狀生長，分布不均，顯示出集落生長趨勢。經(jīng)15～18次傳代，形成較典型的骨髓MSCs。見圖1。

圖1 18代大鼠MSCs(×200)

2.2 誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)變化 鹽酸法舒地爾誘導(dǎo)后30 min細(xì)胞開始出現(xiàn)胞體收縮，細(xì)胞間隙增寬。誘導(dǎo)后120 min，形態(tài)變化最為理想，表現(xiàn)為胞體收縮成球形或錐形，折光性增強，部分細(xì)胞周圍有光暈，有較多長突起，并連接成網(wǎng)狀。繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間，神經(jīng)元樣細(xì)胞明顯增多，但有少量細(xì)胞脫落、死亡(圖2)。

圖2 鹽酸法舒地爾誘導(dǎo)30 min(A)和120 min(B)(×200)

2.3 誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率 鹽酸法舒地爾誘導(dǎo)30、60、90、120 及180 min后細(xì)胞存活率分別為(96.7 ±2.2)%、(95.3 ±1.9)%、(93.8 ±1.8)%、(92.5 ±2.1)%及(90.1 ±1.3)%。

2.4 NSE、NF200及GFAP測定 見圖3。誘導(dǎo)后60、90、120及 180 min，NSE陽性表達(dá)率分別為(66.5 ±1.9)%、(88.1 ±3.2)%、(93.6 ±1.9)%和(93.5±5.4)%，NF200 陽性表達(dá)率分別為(70.1 ±2.9)%、(89.5 ±1.3)%、(98.1 ±1.6)%和(98.3 ±1.9)%，而GFAP陽性表達(dá)率均小于5%。

圖3 誘導(dǎo)120 min NSE(A)、NF200(B)和GFAP(C)蛋白的表達(dá)(免疫熒光染色，×200)

3 討論

目前誘導(dǎo)骨髓MSCs在體外分化成為神經(jīng)細(xì)胞可采用細(xì)胞因子、基因轉(zhuǎn)染和化學(xué)誘導(dǎo)劑等方法。但是前兩者誘導(dǎo)時間長，獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞的百分率較低。作者觀察了ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾誘導(dǎo)骨髓MSCs向神經(jīng)元分化的可行性，結(jié)果顯示，鹽酸法舒地爾可在體外誘導(dǎo)大鼠骨髓MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞主要表達(dá) NSE和NF200，GFAP表達(dá)較少，證明骨髓MSCs誘導(dǎo)后主要是向神經(jīng)元細(xì)胞分化，而不是向膠質(zhì)細(xì)胞分化。AO-EB染色和免疫熒光結(jié)果顯示，鹽酸法舒地爾的誘導(dǎo)效率及誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率較高，且其誘導(dǎo)過程是連續(xù)的，誘導(dǎo)2 h后，細(xì)胞形態(tài)已有明顯變化，省略了預(yù)誘導(dǎo)期，使誘導(dǎo)時間大大縮短。

近年來的研究［4-6］表明，骨髓MSCs的分化是通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的。2006年，Pacary等［7］報道CoCl2聯(lián)合ROCK抑制劑Y-27632可促進骨髓MSCs向多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。2007年，Kamata等［8］在研究人神經(jīng)母細(xì)胞瘤GOTO細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，Rho抑制劑胞外酶C3轉(zhuǎn)移酶和法舒地爾可誘導(dǎo)軸突形成，促進GOTO細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，推測GOTO細(xì)胞的分化和ROCK信號通路密切相關(guān)。骨髓MSCs的定向分化主要涉及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，細(xì)胞形態(tài)改變依賴于持續(xù)的細(xì)胞骨架的重建，肌動蛋白是細(xì)胞骨架的主要成分。Rho激酶是細(xì)胞骨架肌動蛋白的重要調(diào)節(jié)分子，并作為信號分子參與眾多與細(xì)胞骨架有關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)。該研究首次證實ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾可以在體外快速、高效誘導(dǎo)大鼠骨髓MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。推測其機制可能為鹽酸法舒地爾抑制了Rho激酶的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架重建，啟動細(xì)胞分化的過程，同時通過干擾ROCK信號通路與其他信號傳導(dǎo)通路之間本來相對平衡穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，關(guān)閉或激活下游途徑中與細(xì)胞分化相關(guān)的基因，從而促進骨髓MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。

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