冀曉俊 李昂 段美麗 張淑文

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,北京 100050)

核因子κB(NF-κB)是一種廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子,在炎癥刺激時(shí)促進(jìn)多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄,在細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中起重要作用,在炎性反應(yīng)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中,NF-κB的活化可能是一個(gè)中心環(huán)節(jié)[1-2]。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)是核受體超家族成員,它作為一種配體活化轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。GC廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物的各種有核細(xì)胞中,其作用是介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物效應(yīng)。激活的GR通過直接與NF-κB的制了NF-κB的活性而抑制了多種細(xì)胞因子(IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和 TNF),一些和炎癥相關(guān)的酶(COX-2,iNOS)及某些黏附分子(ICAM-1,E-selectin,V-CAM)的轉(zhuǎn)錄[3],從而起到抑制炎性反應(yīng)的作用。

嚴(yán)重膿毒癥的抗炎治療目前仍是一個(gè)有待解決的難題,開發(fā)新的抗炎治療藥物對(duì)控制全身炎性反應(yīng),降低膿毒癥病死率具有重要意義。越來越多的臨床實(shí)踐及基礎(chǔ)研究證實(shí),一些傳統(tǒng)中藥具有明確的抗炎作用。黃芪被認(rèn)為具有良好的抗炎作用[4]。已證實(shí)黃芪的多種分離物均有不同程度抗炎作用,其中以黃芪甲苷作用尤為顯著。本研究觀察黃芪甲苷對(duì)炎癥狀態(tài)下單核細(xì)胞中NF-κB及糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)水平的影響,進(jìn)而推測(cè)黃芪甲苷可能的藥理機(jī)制。

1 資料與方法

黃芪甲苷由中國(guó)科學(xué)院蘭州化物所進(jìn)行提純分離,純度為97.6%;實(shí)驗(yàn)中首先用DMSO將藥物完全溶解,然后再溶解于DMEM培養(yǎng)基(DMSO濃度不超過1%),之后使用0.22μm 濾器過濾除菌,保存于4℃。

Wistar大鼠(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,許可證編號(hào):SCXKII-07-0012);RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(北京元亨圣馬公司);脂多糖(北京碧云天生物技術(shù)研究所;編號(hào):E coli,0111:B4);GR、TNF-α、NF-kB 抗體、全蛋白提取試劑盒、Western Blotting ECL試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;尼龍膜(Schleicher&Schuell公司);PVDF膜(Immobilon TM-P,Millipore公司);CO2孵箱(SANYO MCO-17AI);PCR儀(PTC-200型);超凈工作臺(tái)(SG-400);高速低溫離心機(jī)(Sorvall ST-21)。Western blot電泳儀(美國(guó)Bio-Rad);Western轉(zhuǎn)膜儀(BioRad);凝膠成像系統(tǒng)(Gel-Doc1000,美國(guó)Bio-Rad)。

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分組培養(yǎng)單核細(xì)胞,分為:①正常單核細(xì)胞對(duì)照組(NC);②黃芪甲苷對(duì)照組(AS);③脂多糖對(duì)照組(LPS);④糖皮質(zhì)激素實(shí)驗(yàn)組(LPS+Dex);⑤黃芪甲苷實(shí)驗(yàn)組Ⅰ(LPS+As);⑥黃芪甲苷實(shí)驗(yàn)組Ⅱ(LPS+As+Dex)。實(shí)驗(yàn)中,脂多糖濃度為:100μg?L-1(此濃度下作用72 h,細(xì)胞死亡率接近95%),黃芪甲苷濃度為:100 mg?L-1(黃芪甲苷95%有效量,ED95)。

1.2 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)糖皮質(zhì)激素受體和細(xì)胞因子表達(dá)量的影響

在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分組培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞;培養(yǎng)48 h以后,收獲細(xì)胞;用1×PBS洗滌細(xì)胞3次;用T RIZOL提取細(xì)胞總RNA;以分光光度計(jì)定量細(xì)胞總RNA后;擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)胞因子特異片段,最后Image ProPlus軟件進(jìn)行灰度分析。引物設(shè)計(jì)見表1。

1.3 Western blot方法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)糖皮質(zhì)激素

配膠完成后,將樣品細(xì)胞去培養(yǎng)液后用PBS沖洗2～3遍;加入適量冰預(yù)冷的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解并定量;將不同分組細(xì)胞的蛋白樣品調(diào)整至等濃度后,依次上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及雜交,最后使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法進(jìn)行顯色。

表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)中引物序列

2 結(jié) 果

2.1 脂多糖刺激單個(gè)核細(xì)胞后,黃芪甲苷對(duì)脂多糖刺激細(xì)胞后相關(guān)基因mRNA表達(dá)的情況(圖1)

結(jié)果發(fā)現(xiàn):①LPS刺激后糖皮質(zhì)激素受體-α mRNA表達(dá)量有所下降,加激素組與單純LPS刺激組比較無明顯差異,黃芪甲苷可使糖皮質(zhì)激素受體-αmRNA表達(dá)量表達(dá)顯著增加;②LPS刺激后糖皮質(zhì)激素受體-β mRNA表達(dá)顯著增加,加激素或黃芪甲苷后與單純LPS刺激比較均無明顯差異;③LPS刺激后NF-kB mRNA表達(dá)顯著增加,加激素或黃芪甲苷后與單純LPS刺激比較均無明顯差異;④LPS刺激后TNF-αmRNA表達(dá)增加,地塞米松能抑制其表達(dá),單用黃芪甲苷對(duì)其表達(dá)也具有抑制作用,聯(lián)合激素和黃芪甲苷對(duì)其抑制作用更明顯。

2.2 脂多糖刺激單個(gè)核細(xì)胞后,黃芪甲苷對(duì)脂多糖刺激細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)的情況

分組后,提取細(xì)胞蛋白,通過Western blot方法檢測(cè)下述蛋白(GR 、TNF-α、NF-κB)的表達(dá) ,以 Actin作為內(nèi)參(圖2)。成像后通過Image ProPlus軟件進(jìn)行灰度分析,并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),制成柱形圖。

圖2顯示,蛋白含量檢測(cè)結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果基本一致。此外,還可以明顯看出:正常細(xì)胞GRβ蛋白表達(dá)極低,其表達(dá)水平明顯低于GRα,LPS刺激后GRβ的表達(dá)明顯上升,相比之下,GRα無明顯變化。

3 討 論

黃芪主要含有黃芪苷(astragaloside)I、II、IV 等皂苷類、黃酮類、氨基酸類、多糖類、生物堿等[5]。為明確其中主要抗炎成分,我們經(jīng)初篩實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能明顯保護(hù)體外炎癥狀態(tài)下的單核細(xì)胞。為進(jìn)一步探索黃芪甲苷的保護(hù)機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)主要研究了黃芪甲苷對(duì)NF-κB和糖皮質(zhì)激素受體及細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)水平的影響。

GR是作為糖皮質(zhì)激素(glococorticoid,GC)配體發(fā)揮作用的主要受體。與激素結(jié)合后,活化的GR進(jìn)入細(xì)胞核,以同源二聚體的形式與特異的DNA序列糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid responsive element,GRE)結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。GR-GC復(fù)合體主要通過阻斷NF-κB活化而抑制炎性反應(yīng)[6]。NF-κB是一種廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子,被認(rèn)為是炎性反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)因子,涉及到100多種基因的轉(zhuǎn)錄,包括 IL-1、IL-6、TNF-α等。在無外界刺激時(shí),NF-κB雜二聚體與抑制蛋白IκB結(jié)合,并與PKA的催化亞基(PKAC)結(jié)合,呈非活性狀態(tài),位于胞質(zhì)中。當(dāng)暴露于脂多糖、細(xì)胞因子(IL-1、TNF-α)、紫外線輻射、氧自由基等許多外界刺激下,NF-κB活化?；罨腘F-κB與GR通過蛋白間相互作用,阻斷DNA結(jié)合及隨后的轉(zhuǎn)錄活性而起到相互抑制作用[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:LPS刺激后GR-α水平有所下降,黃芪甲苷可使GR-α表達(dá)顯著增加;LPS刺激后NF-kB及TNF-α表達(dá)顯著增加,激素及黃芪甲苷均對(duì) NF-kB表達(dá)無明顯影響,但激素能抑制TNF-α表達(dá),單用黃芪甲苷對(duì)其表達(dá)也具有抑制作用,聯(lián)合激素和黃芪甲苷對(duì)其抑制作用更明顯。這一結(jié)果通過Western blot和RT-PCR方法在蛋白水平和mRNA水平都得到驗(yàn)證。由此可見,黃芪甲苷能顯著增加GRα的表達(dá),與激素聯(lián)合能顯著抑制細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生,在細(xì)胞水平具有明顯抗炎作用;本研究表明黃芪甲苷增加炎癥狀態(tài)下細(xì)胞的GR表達(dá)可能是其發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵機(jī)制。

GR有不同的亞型,不同型的GR可介導(dǎo)不同的生物學(xué)過程。GRα和GRβ生物學(xué)活性存在差異,GRα在靜息狀態(tài)下主要定位于胞漿,其活性依賴于配體的存在,在胞漿與糖皮質(zhì)激素結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核,以同源二聚體的形式與特異的DNA序列糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid responsive element,GRE)結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí),GRα還以二聚體或單體的形式和其他核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,通過直接的蛋白-蛋白相互作用調(diào)節(jié)它們的功能。與GRα相比,GRβ不能與糖皮質(zhì)激素作用,靜息狀態(tài)下主要分布在胞核內(nèi),GRβ能與GRα以異二聚體形式結(jié)合GRE,從而抑制GRα的活性,對(duì)GRα起著負(fù)調(diào)節(jié)作用[8]。由于GRβ蛋白的半衰期是GRα蛋白的2倍,因此,一些促炎癥細(xì)胞因子刺激將誘導(dǎo)GRβ不成比例地(相對(duì)于GRα)堆積。

本研究并未顯示LPS作用單核細(xì)胞后出現(xiàn)GRα數(shù)量明顯下降。但本研究顯示正常細(xì)胞GRβ蛋白表達(dá)極低,幾乎測(cè)不到,其mRNA水平明顯低于GRα,而在 LPS刺激后GRβ的表達(dá)明顯上升,相比之下,GRα的表達(dá)無明顯變化。由此可見,LPS刺激下GRβ表達(dá)水平上調(diào)可能是嚴(yán)重感染時(shí)出現(xiàn)外周糖皮質(zhì)激素抵抗的機(jī)制之一。

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3 Christman JW,Lancaster LH,Blackwell TS.Nuclear factor κB:a pivotal role in the systemic inflammatory response syndrome and new target for therapy[J].Intensive Care Med,1998,24:1131-1138.

4 Zhang WJ,Hufnaql P,Binder BR,et al.Antiinflammatory activity of astragaloside IV is mediated by inhibition of NF-κB activation and adhesion molecule expression[J].T hromb Haemost,2003,90(5):904-914.

5 Hu JY,Han J,Chu ZG,et al.Astragaloside IV attenuates hypoxia-induced cardiomyocyte damage in rats by upregulating superoxide dismutase-1 levels[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(4):351-357.

6 Zhang ZC,Li SJ,Yang YZ,et al.Effect of astragaloside on cardiomyocyte apoptosis in murine coxsackievirus B3 my ocarditis[J].J Asian Nat Prod Res,2007,9(2):145-151.

7 Mckay LI,Cidlowski JA.Molecular control of immune/inflammatory responses:Interactions between nuclear facto r-kappa B and steroid receptor-signaling pathways[J].Endocr Rev,1999,20:435-459.

8 Bamberger CM,Bamberger AM,de Castro M.Chrousos GP:Glucocorticoid receptor beta,a potential endogenous inhibitor of glucocorticoid action in humans[J].J Clin Invest,1995,95:2435-2441.