關文怡，曹授俊，齊軍喆

（北京農業(yè)職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442）

用激素處理動物進行超數排卵是進行胚胎移植、轉基因、克隆等研究的基礎之一，通過超數排卵獲得大量整齊、優(yōu)質的卵子或受精卵是胚胎移植的關鍵技術之一。近年來，隨著遺傳工程小鼠的大量開發(fā)，人們對小鼠卵母細胞和受精卵的需求量日趨增多，因而完善的超數排卵技術是遺傳工程小鼠研究獲得成功的重要前提條件。本實驗在雌鼠的年齡與體重、激素的注射時間等因素不變的條件下，以C57BL/6小鼠為實驗對象，對其注射不同劑量的PMSG和HCG進行超數排卵，并分析所獲得的卵母細胞的數量和質量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 5～6周齡C57BL/6雌性小鼠30只，8周齡C57BL/6雄性小鼠，中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。

1.2 實驗器械 實體顯微鏡Nikon SM2645，日本Nikon公司生產；手術器械：剪毛剪、手術剪、鑷子等；口吸式移卵管。

1.3 實驗試劑 實驗超數排卵激素（PMSG，HCG）均購自寧波市激素制品有限公司；其余試劑除特殊說明外均為Sigma公司產品。

1.4 實驗方法 選用5～6周齡的C57BL/6雌鼠36只（中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供），自由采食和飲水，室溫 20±2℃，控光（光照 14h/d，6∶00～20∶00）。經過一周的適應性飼養(yǎng)后，按照注射劑量不同隨機分為A、B、C三組，A組8只，B組13只，C組15只。A組注射 PMSG 2.5 IU，HCG 2.5 IU；B 組注射 PMSG 5.0 IU，HCG 5.0 IU；C組注射PMSG 7.5 IU，HCG 7.5 IU。每只小鼠腹腔注射PMSG，間隔48h后分別注射HCG進行超數排卵，再與性成熟同系公鼠合籠，次日早上檢查陰道栓，有栓雌鼠就用頸椎脫臼法處死，然后將輸卵管摘除置于盛有M2培養(yǎng)液的表面皿中，在實體顯微鏡下找到輸卵管膨大部，用1mL注射器沖洗輸卵管，再用移卵管收集卵母細胞。超數排卵處理后，對不同處理組的雌鼠進行卵母細胞計數，以確定不同劑量的激素注射對C57BL/6小鼠超數排卵的影響。

1.5 統(tǒng)計分析 利用SPSS軟件對C57BL/6小鼠不同劑量組的平均取卵數采用單因素方差分析進行檢驗。

2 結果

本實驗分為A、B、C三個劑量組，各組獲得的卵子數量如表1所示。C57BL/6小鼠B組的平均取卵數極顯著地高于A組的平均取卵數；B組的平均取卵數顯著地高于C組的平均取卵數；C組與A組的平均取卵數差異不顯著。

表1 C57BL/6小鼠超數排卵實驗結果

3 分析與討論

在哺乳動物發(fā)情周期中給予大劑量外源性FSH或類似物，可誘發(fā)大量卵母細胞發(fā)育，排卵數可超過正常排卵數的若干倍。在小鼠的超排實驗中，一般用孕馬血清促性腺激素（PMSG）模仿內源性促卵泡素（FSH）的促進卵成熟作用，人絨毛膜促性腺激素（HCG）模仿促黃體素（LH）的誘導作用。超數排卵的成功與否取決于以下幾種因素：雌鼠的年齡與體重、激素的劑量、注射時間以及小鼠的品系。

關于小鼠超數排卵的最適合激素劑量，目前國外多采用PMSG與HCG各5 IU或各7.5 IU劑量，國內有的采用PMSG與HCG各5 IU或各10 IU劑量，也有用PMSG與LH協同處理超排小鼠的報道。由此可知，就激素劑量方面的研究結果也是有一定差異的，這可能與超數排卵受到多種因素的影響有關。對于大多數品系小鼠，推薦的PMSG劑量是腹腔注射5 IU，但對有些品系小鼠PMSG劑量僅2.5 IU或多達10 IU其效果可能更好。李子義等在“不同激素劑量對幼鼠超數排卵及超排卵質量的影響”中報道，以PMSG與HCG各10 IU劑量對5～6周齡小鼠進行超排，結果排卵數分別是42.2枚和40.2枚。

另一種促性腺激素是HCG，用來誘發(fā)成熟卵泡破裂，HCG的注射劑量一般為5 IU，但對某些品系小鼠來說，適合的劑量可能在2.5 IU～10 IU之間。本實驗選用5～6周齡的C57BL/6雌鼠，采用3種不同劑量組合在自由采食和飲水，室溫20±2℃，控光（光照14h/d，6∶00～20∶00）的條件下進行超數排卵，結果表明采用PMSG 7.5 IU、HCG 7.5 IU劑量的這組其排卵數顯著高于其他組，為較好的超數排卵方案。

小鼠超數排卵效果除與激素劑量不同有關外，還可能與實驗小鼠個體的日齡、發(fā)情周期、體重及營養(yǎng)狀況有關。

[1]王建辰.家畜生殖內分泌學[M].北京:農業(yè)出版社，1991.

[2]KodayashiK，OkuyamaM，Fujimoto G，etal.Subzonal insemination with a single spematozoon using manipulation assisted sperm adhesion onto theooplasmic membrance in mouse ova[J].Mol.Rprod Dev，1992，31：223-229.

[3]Kimura Y，Yanagimachi R.Mouse oocytes injected with test l2 cularspermatozoa or round spermatids can develop into normal off spring[J].Development，1995，121：2397-2405.

[4]李 秦，朱德生，劉玉林，等.不同激素對哺乳動物超數排卵作用的研究 [J].實驗動物科學與管理，1997，14（3）：126.

[5]劉紅林，范必勤，陳宜峰，等.小鼠卵母細胞的乙醇激活[J].南京農業(yè)大學學報，1996，19（4）：56-60.

[6]錢菊汾.PMSG配合LH促使小鼠超數排卵效果分析[J].北京農學院學報，2000，15（1）：25-28.

[7]李子義，譚景和，孫興參，等.不同激素劑量對幼鼠超數排卵及超排卵質量的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1999，（3）：224.