張立仁,葉超群,孫天勝,包建玲,劉彥

嗅鞘細(xì)胞因可促進(jìn)軸突再生和髓鞘形成被認(rèn)為是促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的理想候選細(xì)胞,并在臨床試驗(yàn)中顯示出了初步安全性。但其促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的效果并不理想,甚至存在較大分歧。為了系統(tǒng)研究嗅鞘細(xì)胞在促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)中的作用,我們采用來(lái)源于7日齡綠熒光Sprague Dawley(SD)大鼠嗅鞘細(xì)胞,對(duì)其在大鼠正常脊髓和損傷脊髓內(nèi)的遷移情況進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (75±1)日齡SPF二級(jí)雌性SD大鼠12只:微通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;New York University(NYU)打擊器:美國(guó)新澤西大學(xué)W.M.Keck中心提供;恒溫冷凍切片機(jī)、立體定位儀、微量顯微注射器、環(huán)胞霉素注射液、共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡;來(lái)源于7日齡綠熒光SD大鼠的嗅鞘細(xì)胞:北京西山醫(yī)院神經(jīng)外科研究室提供;鼠源抗髓磷脂相關(guān)蛋白(myelin basic protein,MBP)單克隆抗體(SMI-199):Covance;鼠源抗神經(jīng)絲(neurofilment,NF)單克隆抗體(N0142):Sigma;二抗為Alexa熒光羊抗鼠488。兔源抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體:Dako;鼠源抗S-100單克隆抗體::Sigma;二抗為Alexa熒光羊抗鼠633、羊抗小鼠488和羊抗大鼠488。二抗均為分子探針公司(Molecular)產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 上述大鼠隨機(jī)分組,均接受嗅鞘細(xì)胞移植。正常組:按制作脊髓損傷模型方法暴露T8-10脊髓,不實(shí)施打擊,直接在T9脊髓注射細(xì)胞;脊髓損傷中心組:制作脊髓損傷模型后將嗅鞘細(xì)胞移植于損傷部位中心;脊髓損傷臨近組織組:制作脊髓損傷模型后將嗅鞘細(xì)胞移植于距損傷部位中心1 mm處的頭側(cè)、尾側(cè)脊髓中線(xiàn)上。

1.2.2 模型制作 依據(jù)Gruner的方法[1]利用NYU打擊器制作脊髓損傷模型:0.4%戊巴比妥鈉(35±5)mg/kg腹腔注射麻醉,以T10棘突為中心常規(guī)備皮、消毒、鋪巾,以T10棘突為中點(diǎn)作長(zhǎng)約1 cm的縱行切口,逐層剪開(kāi)皮膚、筋膜、鈍性分離椎旁軟組織,暴露T8-10棘突和椎板,游離T10椎板上下緣,咬去T10椎板和T9椎板的下半部分,暴露硬膜,固定 T8和 T11棘突并使大鼠懸空;接通打擊器電路,調(diào)節(jié)打擊高度為25 mm打擊,大鼠立即出現(xiàn)一過(guò)性鼠尾擺動(dòng)和后肢痙攣;逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚;術(shù)后1周內(nèi)每日給予青霉素2×105U肌注2次,每日排尿1次,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞移植

1.2.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備 移植前30 min開(kāi)始消化、洗滌細(xì)胞,用不含血清的DMEM將細(xì)胞稀釋成濃度為1×105/μ l的懸液。

1.2.3.2 細(xì)胞注射 每個(gè)部位注射4個(gè)點(diǎn),深度為1.75 mm 、1.25 mm 、1 mm 、0.5 mm;每點(diǎn)注入 0.5 μ l嗅鞘細(xì)胞懸液,注射速度為0.1 μ l/min,每點(diǎn)注射完畢后留針5 min。自移植前 1 d每天給予環(huán)胞霉素10 mg/kg皮下注射,直至取材。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)及方法

1.3.1 細(xì)胞遷移 移植后1周取材。4%多聚甲醛心臟灌注固定,迅速取出脊髓后,將脊髓分為以損傷部位(正常組以注射位點(diǎn))為中心長(zhǎng)15 mm、頭側(cè)10 mm、腰段10 mm以及尾側(cè)2 mm脊髓段,恒冷箱冰凍切片機(jī)上分別行冠狀和橫切片,片厚10 μ m,每隔8張取1張,直接貼在預(yù)先用0.1%明膠處理過(guò)的載玻片上(每張載玻片貼6張切片)。每組均取第2套切片觀(guān)察細(xì)胞遷移,其他切片-80℃保存,1個(gè)月內(nèi)分別完成免疫熒光染色。

第2套切片用 PBS漂洗10 min/次,共3次,晾干后熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞遷移。

1.3.2 移植細(xì)胞的鑒定 每組均取第1套切片,利用GFAP/S-100免疫熒光雙染進(jìn)行移植細(xì)胞鑒定。主要步驟:從-80℃冰箱內(nèi)取出切片復(fù)溫后,0.01 mol/L PBS漂洗 10 min/次,共 3次,含 10%山羊血清的0.1%PBST常溫封閉2 h,加入相應(yīng)滴度的一抗(GFAP:1∶400,S-100:1∶100),4℃濕盒過(guò)夜,0.01 mol/L PBS漂洗10 min/次,共3次,熒光二抗(1∶400)常溫孵育2 h,漂洗、晾干后封片。

1.3.3 NF和MBP免疫熒光染色 每組均分別取第3、4套損傷部位切片分別進(jìn)行NF和MBP免疫熒光化學(xué)染色[2]。主要步驟同上,其中一抗滴度:NF:1∶400,MBP:1∶200。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 所有大鼠均存活良好。脊髓損傷大鼠在傷后0～5 d可見(jiàn)明顯的口周和眼周充血和血尿;正常大鼠在術(shù)后1～3 d可見(jiàn)活動(dòng)減少,步態(tài)不協(xié)調(diào)。未見(jiàn)其他不良反應(yīng)。

2.2 移植嗅鞘細(xì)胞的遷移 移植后1周時(shí),移植于正常脊髓內(nèi)嗅鞘細(xì)胞主要沿脊髓縱軸方向從注射位點(diǎn)向兩側(cè)在白質(zhì)和灰質(zhì)內(nèi)遷移,部分細(xì)胞突起與脊髓縱軸一致,絕大部分遷移細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則(封三彩圖1.1)。移植于脊髓損傷部位中心的嗅鞘細(xì)胞主要圍繞注射位點(diǎn)沿脊髓縱軸呈橢圓形分布,占據(jù)損傷部位并分布于其周?chē)募顾鑳?nèi),小部分在白質(zhì)內(nèi)向頭側(cè)和尾側(cè)遷移,遷移距離較短(封三彩圖1.2)。移植于距離損傷部位頭側(cè)和尾側(cè)1 mm處的嗅鞘細(xì)胞的主要在白質(zhì)和灰質(zhì)內(nèi)沿脊髓縱軸向損傷部位遷移,還分別有一小部分沿中央管遷移(封三彩圖1.3)。

2.3 移植細(xì)胞的鑒定 S-100和GFAP免疫化學(xué)雙染結(jié)果顯示:部分嗅鞘細(xì)胞表達(dá)S-100,部分同時(shí)表達(dá)S-100和GFAP。(封三彩圖1.4)

2.4 移植嗅鞘細(xì)胞促進(jìn)MBP和NF表達(dá) 脊髓損傷部位切片上可見(jiàn)紅色的MBP(封三彩圖1.5)和NF(封三彩圖1.6)陽(yáng)性纖維伴隨嗅鞘細(xì)胞的遷移而延伸,說(shuō)明移植的嗅鞘細(xì)胞可以促進(jìn)髓鞘形成、軸突再生并為軸突延伸提供“支架”。

3 討論

嗅鞘細(xì)胞移植是目前脊髓損傷修復(fù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),而移植細(xì)胞存活是移植策略促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的前提。本文觀(guān)察了嗅鞘細(xì)胞在正常脊髓和損傷脊髓不同部位的遷移特點(diǎn),結(jié)果顯示:移植的嗅鞘細(xì)胞可在脊髓內(nèi)遷移。

早在1998年,Ramon-Cueto就發(fā)現(xiàn),急性期移植的嗅鞘細(xì)胞在全橫斷損傷脊髓內(nèi)沿3條途徑遷移:①主要沿脊髓縱軸方向在白質(zhì)和灰質(zhì)內(nèi)遷移;②一部分在中央管和蛛網(wǎng)膜下腔遷移[3]。我們?cè)诩顾璐靷笫髞喖毙云谝浦惨舶l(fā)現(xiàn)了相同的遷移特點(diǎn)[2]。來(lái)自成人和成年大鼠鼻黏膜的嗅鞘細(xì)胞在正常脊髓和脊髓半橫斷模型大鼠脊髓內(nèi)也表現(xiàn)出相似的遷移能力[4]。

然而,在 T10水平脊髓壓迫模型[5]、脊髓挫傷模型[6]、脊髓全橫斷模型[7]均有報(bào)道未見(jiàn)移植細(xì)胞的遷移。Lu等利用大鼠脊髓橫斷模型,將嗅鞘細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等移植于損傷部位的頭側(cè)和尾側(cè)脊髓,發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞都能在移植后1 h內(nèi)發(fā)生“遷移”,在移植后24 h到達(dá)損傷部位,且細(xì)胞間的“遷移”沒(méi)有差別。他們認(rèn)為,這種遷移是由于注射壓力作用下的被動(dòng)擴(kuò)散,并非細(xì)胞的主動(dòng)遷移;在大鼠脊髓背側(cè)束損傷后,嗅鞘細(xì)胞并不能成功橋接皮質(zhì)脊髓束纖維長(zhǎng)過(guò)損傷區(qū)[7]。

對(duì)于上述研究結(jié)果的差異,Pearse認(rèn)為與細(xì)胞移植的時(shí)間不同有關(guān):傷后立即移植,在瘢痕未形成前,細(xì)胞可能從注射部位遷移出去;傷后1周的延期移植可能因損傷脊髓內(nèi)膠質(zhì)界面的形成或各種胞外基質(zhì)的存在,如硫酸軟骨素糖蛋白、tenascins粘蛋白、可溶性chemorepellant分子,或與星型-腦膜成纖維網(wǎng)之間的生理作用影響細(xì)胞遷移至宿主正常的脊髓組織[6]。Plant的研究則顯示,傷后立即或傷后7 d將嗅鞘細(xì)胞植入適度挫傷模型,盡管嗅鞘細(xì)胞被反應(yīng)性膠質(zhì)包圍很少遷移至周?chē)M織,但還是形成移植物,P75的免疫化學(xué)染色顯示移植物內(nèi)有大量的內(nèi)源性施萬(wàn)細(xì)胞,影響了嗅鞘細(xì)胞的遷移[8]。上述結(jié)果提示:移植環(huán)境是影響細(xì)胞遷移的重要因素。但是,本研究室的系列研究顯示,無(wú)論是在急性期還是在亞急性期(傷后2～3周)、無(wú)論是單獨(dú)的嗅鞘細(xì)胞還是聯(lián)合施萬(wàn)細(xì)胞移植時(shí),嗅鞘細(xì)胞可以發(fā)生遷移,且遷移途徑相似,說(shuō)明細(xì)胞的遷移取主要決于其本身特性。已有研究證實(shí),體外培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞在不同的時(shí)間可自動(dòng)分化為不同的亞型,不同亞型嗅鞘細(xì)胞的具有不同的遷移能力[9]。

因此,為了促進(jìn)移植嗅鞘細(xì)胞在脊髓內(nèi)的遷移,應(yīng)選擇合適的移植時(shí)機(jī)(細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞移植時(shí)間),并結(jié)合其他的方法改善移植環(huán)境,如聯(lián)合硫酸軟骨素酶的應(yīng)用等。

本研究結(jié)果還顯示,移植的嗅鞘細(xì)胞可促進(jìn)MBP和NF表達(dá),說(shuō)明移植的嗅鞘細(xì)胞可促進(jìn)軸突再生和髓鞘形成,數(shù)量少可能與移植時(shí)間較短,細(xì)胞未能充分發(fā)揮功能有關(guān)。進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行之中。

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[2]葉超群,孫天勝,高爾鏡,等.不同方法共移植的嗅鞘細(xì)胞和雪旺細(xì)胞再損傷脊髓內(nèi)的遷移和促進(jìn)軸突再生[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志,2010,2.

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