黃修解，蒙定水，牛豫潔，楊 柯，曾春暉

(1.廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧 530011;2.廣西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西南寧 530001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流受限特征的疾病。氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD主要累及肺臟，但也可引起全身(或稱(chēng)肺外)的不良效應(yīng)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球 COPD居當(dāng)前死亡原因的第4位。目前對(duì)COPD防治研究已成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)課題。COPD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種因素[2]。近年來(lái)，隨著對(duì)COPD氣道炎癥的深入研究，普遍認(rèn)為激活的炎性細(xì)胞釋放多種介質(zhì)，包括白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等在COPD的發(fā)病中起著重要作用。以筆者為主的研究組前期研究表明，雙三口服液對(duì)COPD有較好的預(yù)防和治療作用，但其作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)法制作COPD大鼠模型，用放射免疫法檢測(cè)雙三口服液對(duì)COPD大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α的含量，進(jìn)一步探討其對(duì)COPD防治作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 取健康成年雄性普通級(jí)Wistar大鼠48只，鼠齡10周，體重160g～180g，由廣西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(桂醫(yī)動(dòng)字11004)。

1.1.2 藥物 雙三口服液(規(guī)格:10ml/支，每支含生藥7.5g，由廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)20060702)。成人每日用量為30ml～60ml，折合生藥量為22.5g～45g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與成人用藥量的換算方法[1]:人用量×0.0026×50=大鼠用量/kg體重。

1.1.3 試劑 IL-8、TNF-α試劑盒購(gòu)自廣州齊云生物技術(shù)有限公司;脂多糖購(gòu)自廣州齊云生物技術(shù)有限公司(由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn))。

1.1.4 主要儀器 AEU-210型電子天平，日本島津廠;722型分光光度計(jì)，上海第二分析儀器廠;80-2型離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作 參照朱慧志[3]法:采用煙霧吸入+脂多糖灌肺復(fù)合因素建立COPD大鼠模型。在造模的第1天、第14天將大鼠以適量乙醚吸入麻醉后，暴露喉頭，以靜脈套管針替代氣管導(dǎo)管行氣管插管，向大鼠氣管內(nèi)注入脂多糖 LPS 100μl(μg/μl)，完畢后將大鼠直立旋轉(zhuǎn) 10s～20s，使 LPS均勻分布于肺部。第2～13天、第15～28天，每天在有機(jī)玻璃密閉箱(80×60×50cm3上方有一直徑為1.2cm的通氣孔)持續(xù)吸入新鮮的香煙霧(南寧卷煙廠生產(chǎn)真龍牌香煙，焦油含量19mg，尼古丁1.2mg)30min，20支/d，每天熏煙后立刻用低于環(huán)境溫度(20℃)5℃冷空氣刺激1h，造模28d結(jié)束。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 將健康普通級(jí)同齡(10周齡)雄性Wistar大鼠48只，體重160g～180g，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組12只。A組(空白對(duì)照組)大鼠正常飼養(yǎng)，每天灌服等量生理鹽水;B、C、D 4組進(jìn)行COPD造模，B組為模型組，C組為雙三口服液干預(yù)組，D組為地塞米松對(duì)照組。B組(模型組)大鼠在COPD模型的同時(shí)，亦正常飼養(yǎng)，每天灌服等量生理鹽水;C組大鼠在制備COPD模型的同時(shí)，于每天熏香煙前按16ml/kg的劑量灌服雙三口服液;D組則給予醋酸地塞米松片4.5mg/kg，給藥容量20ml/kg。

1.2.3 標(biāo)本制作和處理 各組動(dòng)物造模28d結(jié)束后，先將動(dòng)物稱(chēng)重，腹腔內(nèi)注入2%戊巴比妥鈉(25mg/kg)麻醉，將大鼠仰臥位固定，在股動(dòng)脈處取血約5ml，放于試管中待血液自然凝固、室溫3000r/min離心15min后，取上清液即血清分裝于ependorf管置于－20℃冰箱。沿正中線剪開(kāi)皮膚和腹壁肌肉，剪斷兩側(cè)肋骨和胸肌，暴露胸腔。立即用生理鹽水10ml分3次行左肺支氣管肺泡灌洗，回收灌洗液(BALF)，總回收率為60% ～80%，行白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)。同時(shí)剝離胸腺和脾臟后，濾紙吸干殘血后立即用電子天平稱(chēng)重。指數(shù)計(jì)算采用以下公式:胸腺指數(shù)=(胸腺重量/小鼠體重)×100，脾臟指數(shù)=(脾臟重量/小鼠體重)×100。

1.2.4 IL-8、TNF-α的檢測(cè) 用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清中IL-8、TNF-α含量，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)改變

空白組無(wú)支氣管黏膜下肌層增生、肥厚，無(wú)黏膜層、黏膜下層及肌層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)肺泡壁破裂及彈力網(wǎng)破壞。模型組支氣管肺組織的病理改變基本符合人類(lèi)COPD的特點(diǎn)。光鏡下可見(jiàn)支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞部分脫落，杯狀細(xì)胞增生，支氣管黏膜下肌層增生、肥厚，黏膜層、黏膜下層及肌層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);細(xì)支氣管壁周?chē)梢?jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁變薄、腫脹、破裂或形成大泡，彈力網(wǎng)破壞。干預(yù)組和對(duì)照組與模型組比較，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，杯狀細(xì)胞增生明顯減輕，且肺泡壁無(wú)明顯破裂。

2.2 肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)

表1顯示，空白組與模型組、干預(yù)組、對(duì)照組中的BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、單核/巨噬細(xì)胞數(shù)比較，差異有顯著性。

表14 組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)比較(s)

表14 組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)比較(s)

注:與模型組比較:#P<0.01;與對(duì)照組比較:*P>0.05

組 別 n 白細(xì)胞計(jì)數(shù)×108/L細(xì)胞分類(lèi)(%)巨噬細(xì)胞空白組中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 單核/12 0.81±0.13 0.11±0.03 0.03±0.01 0.70±0.14模型組 12 8.76±0.61 3.43±0.33 1.67±0.45 4.57±0.52干預(yù)組 12 4.21±0.23#* 0.72±0.41#* 0.41±0.23#* 2.51±0.23#*對(duì)照組 12 3.97±0.19# 0.63±0.27# 0.36±0.13# 2.31±0.17#

2.3 干預(yù)組與模型組、對(duì)照組胸腺質(zhì)量、脾臟質(zhì)量、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)比較(見(jiàn)表2)。

表2 各組胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟質(zhì)量及脾臟指數(shù)比較(s)

表2 各組胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟質(zhì)量及脾臟指數(shù)比較(s)

注:與模型組比較:#P<0.05;與對(duì)照組比較:*P>0.05

組 別 n 脾臟質(zhì)量(g)脾臟指數(shù) 胸腺質(zhì)量(g)胸腺指數(shù)空白組12 0.946±0.113 0.543±0.045 0.418±0.062 0.240±0.030模型組12 0.705±0.093 0.403±0.032 0.309±0.053 0.177±0.021干預(yù)組12 0.863±0.105 0.496±0.038#*0.421±0.070 0.241±0.027#*對(duì)照組12 0.852±0.121 0.432±0.027#0.417±0.062 0.238±0.029#

2.4 各組大鼠血清中IL-8、TNF-α的濃度比較

表3顯示，模型組大鼠血清中IL-8、TNF-α較空白組明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。干預(yù)組和對(duì)照組大鼠血清中IL-8、TNF-α較模型組比較均明顯下降，差異有顯著性(P<0.05)。干預(yù)組和對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，表明雙三口服液和地塞米松均可降低COPD大鼠IL-8、TNF-α水平。

表34 組IL-6、IL-8、TNF-α濃度的比較(ng/L，s)

表34 組IL-6、IL-8、TNF-α濃度的比較(ng/L，s)

注:與空白組比較:△P<0.01;與模型組比較:#P<0.01;與對(duì)照組比較:*P>0.05

組 別 n IL-8 TNF-α 12 0.423±0.173 10.053±2.311模型組 12 0.873±0.152△ 13.971±2.621△干預(yù)組 12 0.612±0.161△#* 12.091±2.038△#*對(duì)照組 12 0.593±0.134△# 11.936±2.014△#空白組

3 討論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流受限特征的疾病。氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外研究普遍認(rèn)為，慢性阻塞性肺疾病(COPD)病理基礎(chǔ)是氣道壁和肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥及結(jié)構(gòu)改變，致氣道重塑最終導(dǎo)致氣道管腔狹窄和進(jìn)展性氣流阻力增加。細(xì)胞因子在COPD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，而其中主要的致病因子則是IL-8和TNF-α。

IL-8是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的有化學(xué)趨向作用的細(xì)胞因子，由多種參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞產(chǎn)生，如巨噬、中性粒、淋巴和內(nèi)皮細(xì)胞等。大量的研究表明，IL-8在慢性呼吸道炎癥中起著關(guān)鍵性作用，它可以激活中性粒細(xì)胞多方面的功能，包括外形的改變、溶酶體酶的釋放、超氧化物的產(chǎn)生和增加、黏附分子的表達(dá)[4]。TNF-α被認(rèn)為是主要的前炎癥細(xì)胞因子之一。已有研究證明，在TNF-α的刺激下，呼吸道上皮表達(dá)IL-8，最終反復(fù)引起呼吸道慢性炎癥和肺組織損傷[5]。TNF-α還具有巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化作用，TNF-α活化內(nèi)皮細(xì)胞刺激其表達(dá)相應(yīng)的黏附因子，與白細(xì)胞相互作用穿過(guò)血管壁進(jìn)入氣道組織，形成逐級(jí)炎癥反應(yīng)反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致支氣管小氣道上皮脫落，纖毛運(yùn)動(dòng)減弱，肺慢性損傷和阻塞遷延不愈，發(fā)展為 COPD?？梢?jiàn)，以 IL-8、TNF-α為主要細(xì)胞因子導(dǎo)致的氣道炎癥已經(jīng)逐步被認(rèn)為是COPD發(fā)病的重要機(jī)制之一。

雙三口服液由廣西地方特色中草藥“三姐妹”、“三杈苦”和地骨皮等組成?！叭忝谩眲e名“傷寒頭”，味辛苦，性涼，具有祛風(fēng)清熱解毒、化痰止咳的功效?！叭究唷眲e名“三丫苦”，味苦，性寒，具有清熱、祛風(fēng)除濕、解毒的功效。地骨皮味甘，性寒，善于清肺中伏熱，三藥合用，具有解毒祛邪、清宣肺熱、化痰止咳之功效。該藥于1996年經(jīng)南寧市衛(wèi)生局批準(zhǔn)，作為廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院院內(nèi)制劑生產(chǎn)(南藥批[96]05081號(hào))，后于2000年經(jīng)廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳復(fù)審批準(zhǔn)為院內(nèi)中藥制劑([00]09594號(hào))。目前雙三口服液已作為本院院內(nèi)制劑應(yīng)用廣泛，臨床主要用于治療呼吸系統(tǒng)感染性疾病，療效確切。我們的前期臨床研究表明，雙三口服液用于治療急性支氣管炎95例[6]，配合抗菌素治療細(xì)菌性肺炎50 例[7]及 COPD 急性加重期 35 例[8]，配合激素治療肺纖維化12例，均取得了良好的療效。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，雙三口服液對(duì)呼吸道常見(jiàn)菌株有良好的體外抗菌作用，對(duì)炎癥急性期滲出及慢性炎癥或炎癥后期肉芽組織增生有明顯的抑制作用，可增加小鼠酚紅排泌量，通過(guò)降低呼吸道對(duì)刺激物的敏感性而發(fā)揮止咳作用，對(duì)內(nèi)毒素引起的動(dòng)物發(fā)熱模型也有較好的解熱效果。本研究采用2次氣管內(nèi)注入脂多糖加煙熏造模，造模次日治療組給予中藥雙三口服液，對(duì)照組給予地塞米松溶液，空白組和模型組均與等量生理鹽水，4組均以灌胃給藥28d。后行支氣管肺泡灌洗并計(jì)數(shù)灌洗液中細(xì)胞數(shù)及分類(lèi)，放射免疫法測(cè)定各組大鼠血清IL-8、TNF-α的含量，并計(jì)算大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清 IL-8、TNF-α較空白組明顯升高(P<0.01)，治療組大鼠血清IL-8、TNF-α較模型組明顯下降(P<0.05)，模型組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.05)，表明雙三口服液可降低COPD大鼠血清IL-8及TNF-α水平，提高機(jī)體免疫功能，對(duì)COPD有較好的防治作用。

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