倪 青，王 階△，趙安斌，于 斌，王 敏，黃春榮，李恩慶

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510632)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷引起廣泛的結(jié)構(gòu)異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病狀態(tài)，是心肌對(duì)糖尿病的急性反應(yīng)而導(dǎo)致的慢性病理改變。臨床研究多中心1278例糖尿病合并冠心病住院病人在院治療情況發(fā)現(xiàn)，丹參飲使用頻率很高，開展本研究旨在驗(yàn)證丹參飲對(duì)治療糖尿病心肌病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Trizol購(gòu)自invitrogen生物技術(shù)科技公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海貝博生物技術(shù)公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自genecopoeia生物技術(shù)公司，TSP-1、TGF-β1、tribble-3 和 chymase 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) santa cruze生物技術(shù)公司，A-TGFβ1和 LTGF-β1多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司，ABC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)vectro生物技術(shù)公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海貝博生物試劑公司，鏈尿佐菌素購(gòu)自Sigma生物技術(shù)公司。丹參飲(丹參30g，檀香6g，砂仁6g)購(gòu)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，以上藥物丹參和檀香以10倍量水，煎煮1.5h后入砂仁10min，濾出藥液后以6倍量水煎煮1h，合并2次藥液，過(guò)濾并最后濃縮至0.6g/ml。

1.2 動(dòng)物與造模方法

雄性SD大鼠42只，體重200g±20g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分為3組:正常組(n=12)只，對(duì)照組(n=15)和丹參飲組(n=15)。正常組喂以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，對(duì)照組及丹參飲組喂以高脂高熱量飼料。4周后給予對(duì)照組及丹參飲組大鼠1次性腹腔注射鏈脲佐菌素50mg/kg，正常組大鼠給予同等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射;各組以原飼料繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，測(cè)定血糖，對(duì)照組及丹參飲組連續(xù)2次血糖≥16.7 mmol/L且有多飲、多食、多尿的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，共有38只大鼠納入實(shí)驗(yàn)(正常組12只，對(duì)照組和丹參飲組各13只)。各組大鼠繼續(xù)以原飼料喂養(yǎng)9周，同時(shí)丹參飲組每天予以丹參飲7.5ml/kg灌胃，模型組予以等量蒸餾水灌胃。分別在實(shí)驗(yàn)第8周、11周、14周禁食12h后殺死各組大鼠4只，心房取血，離心保留血清－20℃保存以備檢測(cè)血脂、血糖、甘油三酯。采血完畢迅速處死大鼠取出心臟，冰鹽水沖洗，剪除包膜、血管，稱重并計(jì)算心臟重量指數(shù)，垂直于心臟左室長(zhǎng)軸對(duì)稱中點(diǎn)上下切取部分心肌，分別放入10%中性甲醛及2.5%戊二醛中固定，其余部分組織放入－80℃冰箱中保存。共有34只大鼠完成實(shí)驗(yàn)(模型組死亡1只，丹參飲組死亡1只，死亡原因可能為糖尿病并發(fā)癥或感染)。

1.3 心電圖觀察心肌損傷程度

大鼠給予1%戊巴比妥納2ml/kg腹腔注射后做心電圖。

1.4 檢測(cè)血糖甘油三酯總膽固醇的變化

心房取血5ml，離心保留血清－20℃保存以備檢測(cè)血脂、血糖、甘油三酯。

1.5 HE染色

10%中性甲醛固定心肌組織標(biāo)本，石蠟切片，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌病理?yè)p害并拍照，結(jié)合超微結(jié)構(gòu)的改變來(lái)評(píng)價(jià)心肌的病變。

1.6 透射電鏡觀察

在左心室中部留取小塊組織，以2.5%戊二醛固定10min后細(xì)切(1.0×1.0mm)，再固定12h，1%鋨酸固定1h，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)制備超薄切片，電子染色，在荷蘭PHILIPSTECNAI-10型透射電子顯微鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.7 Masson染色

常規(guī)石蠟切片脫蠟后，行Masson染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞呈紅色或黃色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，HMIAS彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)定量分析切片每個(gè)視野中CVF(CVF=同一圖像中膠原面積/所測(cè)視野面積)，排除富含膠原的血管和疤痕區(qū)域。每個(gè)切片選取5個(gè)視野，最后取其均數(shù)。

1.8 Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡

常規(guī)石蠟切片脫蠟后，按試劑盒說(shuō)明依次滴加試劑，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 450nm～500nm，發(fā)射波長(zhǎng)515nm～565nm。每張玻片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的3～5個(gè)視野觀察并由計(jì)算機(jī)自帶掃描分析軟件測(cè)定熒光強(qiáng)度與面積。指標(biāo)的熒光值=平均熒光強(qiáng)度×平均熒光面積。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RNA提取與cDNA的合成:采用Trizol按試劑盒說(shuō)明提取RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度，經(jīng)電泳法檢測(cè)其完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Reamtime PCR檢測(cè)。

表1 引物序列(5′-3′)

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

反應(yīng)體系:2 ×AllinoneTM Q-PCR MIX 10μl，ddH2O 1μl，F(xiàn)orward Primer(4μM)2μl，Reverse Primer(4μM)2μl，Template cDNA 5μl。Total:20μl。

反應(yīng)條件:預(yù)變性:95℃ 1min;變性:95℃ 15s;退火:60℃ 30s;延伸:72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。

1.10 免疫組化染色

載玻片采用多聚賴氨酸行防脫片劑處理，常規(guī)石蠟切片脫蠟，0.3%H2O2封閉。置0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中行微波修復(fù)抗原(中檔火8min～10min，自然冷卻到室溫，反復(fù)3次)。山羊血清封閉，依次加入Ⅰ抗(1∶100小鼠抗 tsp-1，Santa Cruz)、生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的卵蛋白-生物素，37℃孵育30 min。以DAB顯色，脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替Ⅰ抗。用Leica Qwin Plus分析系統(tǒng)對(duì)染色后的圖片進(jìn)行灰度分析，對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的陽(yáng)性反應(yīng)視野照像，計(jì)算其平均灰度值。

1.11 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

于超凈工作臺(tái)上，剪取約100mg組織，加入細(xì)胞裂解液400μl，于冰上研磨，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，于冰上裂解30min后，4℃ 12000r/10min，取上清液到1.5ml離心管中，此即為蛋白樣品，－80℃冰箱中保存。取上述蛋白樣品40μl，BCA試劑盒蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上蛋白樣品(取20μg)經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，恒流(GAPDH:240MA，50min;tsp-1:240MA，140min)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(孔徑0.45μm)上。然后在封閉緩沖液(5%脫脂牛奶或BSA)中封閉1h，將膜放入封閉緩沖液稀釋的Ⅰ抗(稀釋比例:GAPDH:1∶100 稀釋，tsp-1:1∶200 稀釋;A-TGF-β1:1∶100;LTGF-β1:1∶100)中進(jìn)行免疫反應(yīng)，室溫下持續(xù)搖動(dòng)孵育2h，然后4℃過(guò)夜。1×PBST洗滌4次，每次5min。將膜用PBST緩沖液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶6000稀釋)，室溫孵育50min，1×PBST洗滌4次，每次5min。于暗室中滴加新鮮配制的ECL顯色液0.6ml(A、B液等體積混勻)，膜孵育1 min，封入保鮮膜中，壓片，顯影于感光膠片上。以上步驟獨(dú)立重復(fù)3次。用Bandleader 3.0軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，按下述公式分別計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)中樣品蛋白的相對(duì)含量:蛋白相對(duì)含量(該蛋白條帶的灰度值－背景的灰度值)/(內(nèi)參條帶的灰度值－背景的灰度值)，以此比值計(jì)算均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料以s表示，組間參數(shù)的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般生存狀況及生化指標(biāo)變化

模型組和丹參飲組空腹血糖在不同時(shí)間點(diǎn)逐漸降低，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組和丹參飲組大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平逐漸增加，各組不同時(shí)點(diǎn)縱向比較差異顯著(模型組和丹參飲組的甘油三酯的F值分別為F=25.429和F=7.198，P<0.01;模型組和丹參飲組總膽固醇的F值分別為F=9.065和F=10.952，P<0.01);正常組不同時(shí)點(diǎn)縱向比較，大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，與相同時(shí)間點(diǎn)的正常組大鼠比較，模型對(duì)照組和丹參飲組大鼠血清甘油三酯和總膽固醇水平明顯升高，丹參飲組大鼠血清甘油三酯和總膽固醇較模型對(duì)照組明顯減低，各組之間兩兩比較，差異顯著(P<0.01);與相同時(shí)間點(diǎn)的正常組大鼠比較，模型組和丹參飲組大鼠空腹血糖明顯升高，與相同時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，丹參飲組大鼠空腹血糖水平明顯降低，各組之間兩兩比較，差異顯著(P<0.05)。

2.2 心電圖觀察心肌損傷情況

大鼠心電圖顯示，ST段抬高明顯，提示心肌已損傷。

2.3 病理觀察

HE染色可見(jiàn)，正常大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、致密，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞外間質(zhì)較少，可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞(圖1A)。DM大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大、扭曲，細(xì)胞間隙增大，間質(zhì)和血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)增多，成纖維細(xì)胞增多，并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。丹參飲組介于兩者之間，與模型對(duì)照組相比，細(xì)胞間隙減小，間質(zhì)和血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)減少(圖1C)。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色觀察(200×)

2.4 電鏡觀察心肌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

正常大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間質(zhì)膠原含量很少，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜結(jié)構(gòu)正常(圖2A)。DM大鼠心肌細(xì)胞肌絲纖維稀疏、扭曲、斷裂，線粒體腫脹，數(shù)量減少，排列紊亂，空泡變性，部分嵴斷裂，糖原減少，間質(zhì)膠原增生，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，毛細(xì)血管基底膜增厚(圖2B)。丹參飲組較DM組明顯減輕，間質(zhì)膠原沉積較少，毛細(xì)血管基底膜增厚減輕，介于正常組和對(duì)照組之間(圖2C)。

圖2 各組大鼠心肌組織電鏡觀察(15000×)

2.5 Masson染色觀察膠原表達(dá)情況

采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行心肌組織膠原相對(duì)含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，糖尿病心肌病變大鼠心肌組織膠原相對(duì)含量明顯增加(P<0.01)，提示該模型大鼠存在膠原纖維增生病變;與模型組相比，丹參飲組能減少心肌組織膠原相對(duì)含量(P<0.05)，提示丹參飲可以明顯抑制膠原纖維增生。

圖3 各組大鼠心肌組織masson染色(100×)

表1 各組大鼠左室組織Masson染色膠原纖維定量分析結(jié)果(s)

表1 各組大鼠左室組織Masson染色膠原纖維定量分析結(jié)果(s)

注:與正常組比較:△P<0.01;與模型對(duì)照組比較:*P<0.05

組 別n 間質(zhì)膠原纖維體積正常對(duì)照組12 10.38±2.76模型對(duì)照組 11 18.42±3.55△丹 參 飲 組 12 15.66±3.12*

2.6 Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡

正常組大鼠的心肌組織僅可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞凋亡(圖4A)，與正常組相比，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多(圖4B)，與模型組相比，丹參飲組凋亡細(xì)胞顯著減少(圖4C)。

圖4 各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡水平(200×)

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

與正常組相比，模型組 TSP-1和 TRB-3的mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，丹參飲組TSP-1和TRB-3的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠心肌TSP-1和TRB-3的mRNA表達(dá)水平(s)

表2 各組大鼠心肌TSP-1和TRB-3的mRNA表達(dá)水平(s)

注:△P<0.01，*P<0.05

組 別n TSP-1 TRB-3正常對(duì)照組12 0.0096±0.0042 0.0073±0.0025模型對(duì)照組 11 0.0152±0.0051* 0.0137±0.0031△丹 參 飲 組 12 0.0126±0.0049* 0.0096±0.0014△

2.8 免疫組織化學(xué)染色

TSP-1染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒，定位于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)。正常組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒(圖5A)，模型組心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)濃密的深棕色顆粒(圖5B)，丹參飲組心肌細(xì)胞內(nèi)棕褐色顆?？梢?jiàn)明顯減少(圖5C)。與正常組相比，模型組心肌TSP-1蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，丹參飲組TSP-1表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 各組大鼠心肌TSP-1免疫組織化學(xué)染色(200×)

TGF-β1染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒，定位于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)。正常組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)散在、稀疏的淺棕色顆粒(圖6A)，模型組心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)濃密的深棕色顆粒(圖6B)。丹參飲組心肌細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒可見(jiàn)明顯減少(圖6C)。與正常組相比，模型組心肌TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，丹參飲組TSP-1表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 各組大鼠心肌組織TGF-β1免疫組織化學(xué)染色(200×)

Chymase染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒，定位于心肌細(xì)胞間隙及肥大細(xì)胞胞漿，正常組心肌組織內(nèi)可見(jiàn)散在稀疏的淺棕色顆粒(圖7A)，DCM組心肌組織內(nèi)可見(jiàn)較多的深棕色顆粒(圖7B)。丹參飲組心肌組織內(nèi)棕色顆?？梢?jiàn)明顯減少(圖7C)。與正常組相比，模型組心肌Chymase蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，丹參飲組Chymase表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖7 各組大鼠心肌組織Chymse蛋白免疫組織化學(xué)染色(200×)

TRB-3染色陽(yáng)性信號(hào)為棕色顆粒，定位于心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)散在稀疏的淺棕色顆粒(圖8A)，模型組心肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)濃密的深棕色顆粒(圖8B)。丹參飲組心肌細(xì)胞內(nèi)棕色顆?？梢?jiàn)明顯減少(圖8C)。與正常組相比，模型組心肌TRB-3蛋白表達(dá)量明顯升高;與模型組相比，丹參飲組TSP-1表達(dá)量明顯降低，3個(gè)組兩兩相比差異顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖8 各組大鼠心肌組織TRB-3蛋白免疫組織化學(xué)染色(200×)

2.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

心肌組織中 TGF-β1是以活性的 A-TGF-β1和非活性的L-TGF-β1形式存在的，與正常組相比，心肌組織中 TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 3 種蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，丹參飲組的 TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 3 種蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05～0.01)。

表3 各組大鼠心肌TSP-1、A-TGF-β1和L-TGF-β1蛋白的表達(dá)水平(s)

表3 各組大鼠心肌TSP-1、A-TGF-β1和L-TGF-β1蛋白的表達(dá)水平(s)

注:△P<0.01，*P<0.05

組 別 n TSP-1 A-TGF-β1 L-TGF-β1 12 93.225±5.371 106.429±6.32 102.461±6.124模型對(duì)照組 11 129.772±6.548△ 139.812±7.26△ 144.633±7.377△丹 參 飲 組 12 118.392±6.226△ 124.385±6.65*126.377±6.924正常對(duì)照組*

3 討論

本研究以高糖高脂高熱量飲食誘導(dǎo)出胰島素抵抗，加小劑量STZ注射建立的動(dòng)物模型。HE染色病理切片顯示，心肌細(xì)胞肥大、扭曲，細(xì)胞間隙增大，間質(zhì)和血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)增多。電鏡觀察顯示，心肌細(xì)胞排列稀疏、斷裂并有大量膠原纖維分布。結(jié)合心電圖示心肌受損，提示本研究已成功地建立了糖尿病心肌病的動(dòng)物模型。

丹參飲出自《時(shí)方歌括》，由丹參、檀香、砂仁3味藥物組成，方中重用丹參活血祛瘀為君藥;檀香、砂仁行氣寬中而止痛為佐使，主要用于血瘀氣滯、心胃諸痛證。在臨床上主要應(yīng)用于血瘀氣滯型胸痹心痛。研究表明，丹參飲可以顯著提高心肌缺血的保護(hù)能力，有效緩解缺血對(duì)心肌造成的損傷，使酶的外漏減少，從而起到保護(hù)心肌的作用[1]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，丹參飲可使冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張，增加冠脈血流量;對(duì)周圍血管也有擴(kuò)張作用，而致血壓降低。當(dāng)心功能不全時(shí)，可改善心肌收縮力，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)及體內(nèi)血流的再分配，降低冠心病患者的血漿黏度，加速紅細(xì)胞電泳率，改善紅細(xì)胞比容，進(jìn)而改善微循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、致密，細(xì)胞間隙較少，masson染色顯示心肌細(xì)胞間僅有少量膠原纖維，電鏡觀察心肌細(xì)胞排列整齊，線粒體完整，低倍鏡下(1250×)成纖維細(xì)胞數(shù)目較少(≤2個(gè))，而且成纖維細(xì)胞周圍膠原纖維少。與正常組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙較多，masson染色顯示心肌細(xì)胞間充滿大量膠原纖維，電鏡觀察心肌細(xì)胞肌絲斷裂崩解，線粒體腫脹、破裂，低倍鏡下(1250×)成纖維細(xì)胞數(shù)目較多(≥5個(gè))，而且成纖維細(xì)胞周圍聚集大量膠原纖維。丹參飲組介于兩者之間，與模型組相比，丹參飲組大鼠心肌細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞間隙膠原纖維較少，電鏡低倍鏡下(1250×)成纖維細(xì)胞數(shù)目為2～4個(gè)，成纖維細(xì)胞周圍有中等量的膠原纖維，提示丹參飲可以有效延緩糖尿病大鼠心肌病發(fā)生。

TSP-1對(duì)多種間質(zhì)細(xì)胞的分化、增生具有很強(qiáng)的調(diào)控作用，其異常表達(dá)在多種類型纖維化疾病進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[2]。有研究表明，糖/TSP-1/TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)途徑在糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[3]。最近1項(xiàng)有關(guān)TRB3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究結(jié)果表明，TRB3對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的連鎖反應(yīng)具有廣泛和特異的調(diào)控作用，TRB3與MAPKK結(jié)合而調(diào)控MAPK通路信號(hào)蛋白的活性[4]。大量研究證實(shí)，MAPK不僅是糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程的關(guān)鍵細(xì)胞因子[5]，也是心肌纖維化過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6]。研究證實(shí)，糖尿病狀態(tài)下，心肌局部升高的Ang II，通過(guò)多條途徑引起心肌氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)膠原沉積以及心肌纖維化，在糖尿病心肌病變變的發(fā)生中扮演著重要角色[7]。Chymase除了通過(guò)生成Ang II引起心肌病變，還可能直接激活TGF-β從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，促使心肌纖維化[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型對(duì)照組masson染色膠原纖維表達(dá)增多，電鏡觀察成纖維細(xì)胞周圍膠原纖維表達(dá)增高，免疫組化結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞 TSP-1、TGF-β1、chymase、TRB-3表達(dá)量均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，丹參飲組大鼠心肌細(xì)胞TSP-1、TGF-β1、chymase、TRB-3 有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合masson染色及電鏡結(jié)果，提示丹參飲可以有效緩解糖尿病心肌病的心肌纖維化進(jìn)程，減輕糖尿病心肌病的纖維化程度。Western半定量結(jié)果顯示，與正常組相比，模型對(duì)照組的TSP-1、A-TGF-β1、L-TGF-β1 表達(dá)量均明顯升高。熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，模型對(duì)照組的TSP-1、TRB-3 mRNA的表達(dá)量增高，說(shuō)明模型組大鼠心肌組織中纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵因子在基因和蛋白水平均表達(dá)明顯增高。非活性的L-TGF-β1雖然不直接參與糖尿病心肌病的纖維化過(guò)程，但是表達(dá)水平仍然升高，這與其他研究結(jié)果一致，可能是由于TGF-β1基因表達(dá)增多，從而導(dǎo)致L-TGF-β1表達(dá)量也增高。與模型組相比，丹參飲組的TSP-1、ATGF-β1、L-TGF-β1 表達(dá)量均明顯降低，提示丹參飲可以通過(guò)降低纖維化過(guò)程中的細(xì)胞因子TSP-1、ATGF-β1、L-TGF-β1，從而延緩心肌纖維的發(fā)生。

[1]李然，劉立萍.丹參飲對(duì)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(12):1944-1945.

[2]Morishima Y，Nomura A，Uchida Y，et al.Triggering the induction of myofibroblast and fibrogenesis by airway epithelial shedding[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24:1-11.

[3]鐘鳴，張薇，苗雅，等.糖/血小板反應(yīng)素-1/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1信號(hào)傳導(dǎo)途徑在糖尿病心肌病發(fā)病中的作用[J].中華心血管病雜志，2006，34(3):217-220.

[4]Regulation of expression and signaling modulator function of mammalian tribbles is cell-type specific[J].Immunllogy Letters，2006，10:171-177.

[5]Ling Li，SAWAMURA Tatsuya，RENIER Geneviève.Glucose enhances human macrophage LOX-1 expression:Role for LOX-1 in glucose-induced macrophage foam cell formation[J].Cire Res，2004，94(7):892-90.

[6]Park JK，F(xiàn)ischer R，Dechend R，et al.P38 mitogen-activated protein kinase inhibition ameliorates angiotensin II-induced target organ damage[J].Hypertension，2007，49(3):481-489.

[7]叢麗，俞茂華，李益明.Chymase與糖尿病心肌病變[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2004，24(增刊):33-35.