桂世昌，楊峰，張寶藝，張新全，黃琳凱，馬嘯

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 雅安625014）

扁穗牛鞭草（Hemarthriacompressa）屬禾本科黍亞科牛鞭草屬，為多年生根狀莖禾草［1］，喜溫暖濕潤(rùn)氣候［2］。它是一種生長(zhǎng)期長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度快、再生力強(qiáng)和產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)牧草［3］。不過(guò)扁穗牛鞭草由于結(jié)實(shí)率低（2個(gè)國(guó)家審定品種“廣益”、“重高”自然傳粉結(jié)實(shí)率分別為7.8%和6.6%［4］），主要靠根莖和匍匐莖進(jìn)行無(wú)性繁殖［3］。關(guān)于扁穗牛鞭草種質(zhì)資源［3］、光合特性［5］、化學(xué)除雜［6］、化感作用［7］、農(nóng)藝性狀［8］和根際微生物［9］等已進(jìn)行廣泛的基礎(chǔ)研究，而關(guān)于扁穗牛鞭草抗旱性研究還尚未見(jiàn)諸文獻(xiàn)。近年來(lái)，西南地區(qū)受到干旱影響持續(xù)加重，2006年更是遭遇特大干旱［10］。為了更好地利用扁穗牛鞭草，促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，本研究分析2種國(guó)審扁穗牛鞭草在水分脅迫下根系保護(hù)酶的變化，為進(jìn)一步選育抗旱性扁穗牛鞭草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)基地種植的國(guó)審品種“廣益”和“重高”扁穗牛鞭草。材料種植于高1.2 m，直徑0.1 m的PVC管中。試驗(yàn)用土為大田的沙壤土（白堊紀(jì)灌口組紫色沙頁(yè)巖風(fēng)化的堆積物形成的紫色土），過(guò)篩，去掉石塊、雜質(zhì)，土壤有機(jī)質(zhì)含量14.53 g／kg，速效氮含量101.45 mg／kg，速效磷含量4.85 mg／kg，速效鉀含量342.56 mg／kg，p H 值6.3。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2009年4月初－10月中旬在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中進(jìn)行。選取長(zhǎng)勢(shì)相近的莖段，每支PVC管種植3段，定苗2段，每個(gè)品種種植20管。于6月下旬扁穗牛鞭草拔節(jié)期時(shí)澆透一次水，測(cè)定土壤含水量，并選取植株須根系測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）。以后進(jìn)行控水處理（一直不澆水），每隔14 d測(cè)定1次以上指標(biāo)，共測(cè)定4次，每次各指標(biāo)3個(gè)重復(fù)。

1.2.1 土壤水分測(cè)定 用環(huán)刀取待測(cè)根際土壤，稱(chēng)取鋁質(zhì)土盒的質(zhì)量，再稱(chēng)取環(huán)刀中部土壤于土盒中，然后置于105℃烘箱中，烘干12 h，冷卻后稱(chēng)量，進(jìn)行計(jì)算，即可得土壤水分含量［11］。

1.2.2 SOD活性、CAT活性、POD活性、MDA含量 采用南京建成生物工程研究所研制SOD、CAT、POD、MDA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。其中，SOD活性定義為：每mg組織蛋白在1 m L反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位（U／mg）。POD活性定義為：在37℃條件下，每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μg的底物的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U／mg）。CAT活性定義為：每g組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.52的底物中的過(guò)氧化氫相對(duì)量為1個(gè)過(guò)氧化氫酶的活力單位（U／g）。MDA含量單位為每mg蛋白所含MDA納摩爾量（nmol／mg）。

2 結(jié)果與分析

2個(gè)品種在干旱脅迫下，根系POD初期活性都呈上升趨勢(shì)。14 d時(shí)，廣益和重高POD活性都達(dá)到最大值，且活性大致相同。隨著時(shí)間推移，2種扁穗牛鞭草POD活性出現(xiàn)明顯降低（圖2）。重高在14～28 d時(shí)出現(xiàn)降低，幅度達(dá)到62%，比同期廣益高15%。處理期間，2個(gè)品種POD活性差異不顯著。

2.1 土壤含水量變化

廣益和重高的土壤含水量都呈顯著的下降趨勢(shì)（表1）。結(jié)果表明，控水期間造成了明顯的土壤水分脅迫。同時(shí)可以看出2個(gè)品種的土壤含水量變化基本一致，沒(méi)有明顯的差異（表1），說(shuō)明對(duì)2個(gè)品種所進(jìn)行的干旱脅迫處理是相一致的。方差分析表明，同一品種中不同處理時(shí)間，土壤含水量差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 SOD活性變化

在整個(gè)研究期間，2個(gè)扁穗牛鞭草品種根系SOD活性存在著極顯著的差異（P＜0.01）。水分脅迫初期，扁穗牛鞭草根系SOD活性明顯加強(qiáng)（圖1），在14 d時(shí)達(dá)到最大值。其中廣益SOD活性在14 d時(shí)達(dá)到654.727 U／mg，是重高活性2倍。隨著水分脅迫天數(shù)的增加，2種扁穗牛鞭草SOD活性均下降，呈明顯拋物線趨勢(shì)，在42 d時(shí)接近水分脅迫初始水平，廣益略高于重高。

表1 不同脅迫期內(nèi)廣益和重高土壤含水量Table 1 The soil moisture where“Guangyi”and“Chonggao”grew in different stages of water stress

2.3 POD活性變化

圖1 水分脅迫下SOD活性的變化Fig.1 The changes in SOD activity under water stress

圖2 水分脅迫下POD活性的變化Fig.2 The changes in POD activity under water stress

2.4 CAT活性變化

水分脅迫初期，重高和廣益根系CAT活性增加，中后期根系CAT活性出現(xiàn)大幅度的下降（圖3）。在整個(gè)水分脅迫中，重高和廣益扁穗牛鞭草CAT活性差異顯著（P＜0.05），在0～14 d期間，2種植物根系CAT都增加近7.5倍，后期下降速度基本一致，42 d時(shí)CAT活性接近處理初期水平。

2.5 MDA含量變化

水分脅迫初期，2種扁穗牛鞭草根系MDA含量出現(xiàn)小幅上升。隨著水分脅迫加劇，廣益和重高根系MDA含量開(kāi)始大幅下降，但在整個(gè)過(guò)程中重高M(jìn)DA含量始終高于廣益（圖4），差異極顯著（P＜0.01）。水分脅迫14 d時(shí)，重高和廣益根系MDA含量都達(dá)到最大值，重高為廣益的3倍。28～42 d時(shí)，廣益和重高M(jìn)DA含量都出現(xiàn)下降，重高M(jìn)DA含量仍高于廣益，保持在45 nmol／mg。

圖3 水分脅迫下CAT活性的變化Fig.3 The changes in activity of CAT under water stress

圖4 水分脅迫下MDA含量的變化Fig.4 The changes in contents of MDA under water stress

3 討論

水分脅迫是植物最易遭受的逆境脅迫，也是限制植物生長(zhǎng)的重要因素。水分脅迫下，植物表現(xiàn)出多方面不適應(yīng)，生長(zhǎng)減緩，光合速率下降［12］，葉綠體消解［13］，質(zhì)膜受損，細(xì)胞內(nèi)含物大量外滲等［14］。土壤是植物生長(zhǎng)必須的基質(zhì)，為植物提供適宜生長(zhǎng)的水肥氣熱條件［15］。因而植物對(duì)于土壤水分含量高低極為敏感，土壤水分含量高低可以作為植物受干旱脅迫大小的表征條件之一。

在水分脅迫下，SOD、POD和CAT這3種酶是保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基傷害的保護(hù)酶，保持較高水平酶活力，可降低膜脂過(guò)氧化程度，減輕膜受到傷害的程度［16］。許多研究已經(jīng)證明，這3種酶在水分脅迫下活性的高低與植物抗旱性成正相關(guān)［17－20］。SOD在其中主要是將 O2－歧化為 H2O2，再通過(guò)POD和CAT將 H2O2清除［21，22］。在正常情況下，3種保護(hù)酶維持著自由基的平衡［23］。水分脅迫造成植物傷害的重要原因之一，就是細(xì)胞內(nèi)O2－的產(chǎn)生與清除失衡［24］。而植物體內(nèi)過(guò)剩自由基的毒害之一是引發(fā)膜脂過(guò)氧化作用，造成膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物丙二醛（MDA）又可與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)酶結(jié)合、交聯(lián)，從而使之失活，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)與功能。因此，MDA含量高低，可代表植物受到干旱脅迫的程度和膜脂過(guò)氧化程度［25］。

植物根系作為直接和土壤接觸的器官，對(duì)于土壤水分的感受最為直接，同時(shí)也是植物在水分脅迫下最先作出反應(yīng)的器官，研究根系可較好反應(yīng)植物對(duì)水分脅迫應(yīng)激機(jī)理。在本研究中，選取植物根系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在水分脅迫初期，2種扁穗牛鞭草廣益和重高根系SOD、POD、CAT變化趨勢(shì)相同，都有大幅度升高，這與對(duì)苜蓿（Medicagosativa）［26］、草地早熟禾（Poapratensis）［27］、紫羊茅（Festucarubra）［27］、多年生黑麥草（Loliumperenne）［27］、玉米（Zeamays）［28］的研究結(jié)果相吻合。而14 d后出現(xiàn)下降可能有以下幾個(gè)原因：一是由于產(chǎn)生大量自由基，破壞SOD、POD和CAT產(chǎn)生機(jī)制［29，30］，二是超出保護(hù)酶系統(tǒng)的清除能力［31］，三是植物順利渡過(guò)干旱閾值期而產(chǎn)生耐受性。綜合本試驗(yàn)全過(guò)程，結(jié)合扁穗牛鞭草在干旱脅迫下的宏觀表現(xiàn)，筆者傾向于第3種原因。在整個(gè)處理期間，SOD、POD和CAT 3種保護(hù)酶先上升后下降，這與在檉柳（Tamarixchinensis）［32］、大豆（Glycine max）［33］、夏玉米［33］研究相同。初期MDA含量升高，可能是干旱脅迫對(duì)質(zhì)膜損傷造成的。而同期3種保護(hù)酶與MDA呈極顯著相關(guān)的上升，則表明活性酶升高主要是由MDA所誘導(dǎo)［34］，而非干旱脅迫直接造成。在干旱脅迫到14 d時(shí)，廣益和重高扁穗牛鞭草根系MDA含量達(dá)到最大值，表明質(zhì)膜受到過(guò)氧化傷害達(dá)到最大值。在28～42 d時(shí)，根系MDA、SOD、POD、CAT開(kāi)始出下降，結(jié)合2種扁穗牛鞭草葉片出現(xiàn)枯黃和萎蔫主要集中在25～35 d，而35 d以后葉片變化不明顯，主要是維持為主。這些現(xiàn)象出現(xiàn)可能與扁穗牛鞭草抗旱性反應(yīng)閾值有關(guān)［35，36］，同時(shí)30 d左右可能是扁穗牛鞭草抗旱性閾值期，是決定其抗旱大小的臨界期，有重要的研究意義。至于后期扁穗牛鞭草主要以維持為主，甚至廣益出現(xiàn)部分葉片返青的現(xiàn)象則表明扁穗牛鞭草在順利渡過(guò)干旱閾值期，對(duì)干旱脅迫產(chǎn)生較強(qiáng)的適應(yīng)性和耐受性，這些宏觀變化也與MDA含量和3種保護(hù)酶活性下降的微觀變化相一致。至于在42 d后是否還會(huì)出現(xiàn)MDA含量和3種保護(hù)酶活性上升，則需要進(jìn)一步延長(zhǎng)試驗(yàn)觀察期進(jìn)行研究。在整個(gè)處理期間，根系POD含量差異不顯著，POD對(duì)于2種扁穗牛鞭草抗旱性貢獻(xiàn)大小還需要做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

綜上所述，SOD、POD、CAT在水分脅迫下，先上升后下降，在14 d時(shí)達(dá)到最大值，可能與扁穗牛鞭草在水分脅迫下保持正常生長(zhǎng)最長(zhǎng)時(shí)間一致。廣益扁穗牛鞭草MDA含量遠(yuǎn)低于重高扁穗牛鞭草，從而膜損傷較少。結(jié)合試驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)，重高在25 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，廣益在35 d開(kāi)始出現(xiàn)同樣現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，重高大部分葉片出現(xiàn)枯黃，廣益仍保持綠色，表明廣益扁穗牛鞭草的抗旱能力大于重高扁穗牛鞭草。

［1］吳仁潤(rùn)，盧欣石.中國(guó)熱帶亞熱帶牧草種質(zhì)資源［M］.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1992：127－128.

［2］董寬虎，沈益新.飼草生產(chǎn)學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：152－155.

［3］楊春華，張新全，李向林，等.牛鞭草屬種質(zhì)資源及育種研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（2）：7－12.

［4］吳彥奇，杜逸.牛鞭草的研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，10（2）：260－265.

［5］陳靈鷲，楊春華，傅鮮桃，等.扁穗牛鞭草光合特性研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，25（4）：484－489.

［6］曾祥剛，李權(quán)，曾勇.扁穗牛鞭草的化學(xué)除雜方法［J］.貴州畜牧獸醫(yī)，2006，30（6）：31－33.

［7］楊菲，黃乾明，楊春華.扁穗牛鞭草水浸液化感作用及化學(xué)成分分析［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26（3）：232－237.

［8］楊春華，張新全，李向林，等.牛鞭草資源農(nóng)藝性狀和育種研究［J］.四川草原，2004，（6）：8－12.

［9］榮麗，李賢偉，朱天輝，等.光皮樺細(xì)根與扁穗牛鞭草草根分解的土壤微生物數(shù)量及優(yōu)勢(shì)類(lèi)群［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（4）：117－124.

［10］鄒旭愷，高輝.2006年夏季川渝高溫干旱分析［J］.氣候變化研究進(jìn)展，2007，3（3）：149－154.

［11］中科院南京土壤研究所土壤物理研究所.土壤物理性質(zhì)測(cè)定法［M］.北京：科學(xué)出版社，1978.

［12］高天鵬，方向文，李金花，等.水分對(duì)檸條萌蘗株和未平茬株光合參數(shù)及調(diào)滲透物質(zhì)的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2009，26（5）：103－109.

［13］萬(wàn)里強(qiáng)，石永紅，李向林，等.高溫干旱脅迫下三個(gè)多年生黑麥草品種葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（1）：25－31.

［14］李合生.現(xiàn)代植物生理學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2006：353－354.

［15］關(guān)連珠.普通土壤學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007：5－6.

［16］王忠華，李旭晨，夏英武.作物抗旱的作用機(jī)制及其基因工程改良研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2002，（1）：16－19.

［17］Scandalios J G.Oxygen stress and superoxide dismutases［J］.Plant Physiology，1993，101：7－15.

［18］Griffiths H，Parry M A J.Plant responses to water stress［J］.Annals of Botany，2002，89：801－802.

［19］蔣明義，荊家海，王韶唐.水分脅迫與植物膜脂過(guò)氧化［J］.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，19（2）：88－96.

［20］祈娟，徐柱，王海清，等.旱作條件下披堿草屬植物葉的生理生化特征分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（1）：39－45.

［21］Sen G A，Webb R P，Holaday A S.Over－expression of superoxide dismutase protects plant from oxidative stress.Induction of ascorbate peroxidase in superoxide dismutase－over expressing plants［J］.Plant Physiology and Biochemistry，1993，103：949－957.

［22］鐘鵬，朱占林，李志剛，等.PEG處理對(duì)大豆幼苗活力及膜系統(tǒng)修復(fù)的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004，（4）：260－263.

［23］李付廣，李鳳蓮，李秀蘭.鹽脅迫對(duì)棉花幼苗保護(hù)酶系統(tǒng)活性的影響［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，17（3）：52－55.

［24］Price A H，Atherton N M，Hendry G A F.Plants under drought－stress generate activated oxygen［J］.Free Radical Research Communication，1989，8：61－66.

［25］Babbs C F，Pham J A，Coolbaugh R C.Lethal hydroxyl radical production in paraquat－treated plants［J］.Plant Physiology and Biochemistry，1989，90：1267－1275.

［26］李造哲.10種苜蓿品種幼苗抗旱性的研究［J］.中國(guó)草地，1991，（3）：1－3.

［27］王代軍.溫度脅迫下幾種冷季型草坪草抗性機(jī)制的研究［J］.草業(yè)科學(xué)，1998，（1）：21－25.

［28］宋鳳斌，戴俊英.水分脅迫對(duì)玉米活性氧清除酶活性的影響［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17（3）：9－15.

［29］Dhindsa R S.Protein synthesis during rehydration of rapidly driedTortularuralis：Evidence for oxidation injury［J］.Plant Physiology，1987，85：1094－1098.

［30］李建武，王蒂.水分脅迫對(duì)馬鈴薯試管苗抗氧化酶活性的影響［J］.北方園藝，2008，（1）：7－9.

［31］任麗花，翁伯琦，黃炎和，等.水分脅迫對(duì)閩引圓葉決明活性氧代謝的影響［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，23（1）：63－67.

［32］王霞，侯平，尹林克，等.土壤水分脅迫對(duì)怪柳體內(nèi)膜保護(hù)酶及膜脂過(guò)氧化的影響［J］.干旱區(qū)研究，2002，19（3）：17－21.

［33］王啟明.干旱脅迫對(duì)大豆苗期葉片保護(hù)酶活性和膜脂過(guò)氧化作用的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（4）：918－921.

［34］葛體達(dá)，隋方功，白莉萍，等.水分脅迫下夏玉米根葉保護(hù)酶活性變化及其對(duì)膜脂過(guò)氧化作用的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（5）：922－928.

［35］王貞紅，張文輝，何景峰，等.瑞典能源柳無(wú)性系保護(hù)酶活性對(duì)水分脅迫的響應(yīng)［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23（2）：21－23.

［36］唐曉敏，王文全，馬春英.長(zhǎng)期水分脅迫下干草葉片的抗旱生理響應(yīng)［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（2）：16－21.