申 靜,馬 華,武麗萍,宮建芳,杜海斌

心腦血管病是影響人們健康的重要疾病,動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心腦血管病的主要原因,而內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)。1997年Asahara等[1]從外周血中分離出一類能分化成為內(nèi)皮細(xì)胞,參與血管形成的單核細(xì)胞,并將之命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。EPCs不僅參與出生后血管形成,而且參與修復(fù)損傷血管內(nèi)皮,在缺血性疾病中扮演著重要的角色[2,3]。隨著對(duì)NO和心血管疾病之間關(guān)系研究的不斷深入,使人們認(rèn)識(shí)到NO在心血管疾病發(fā)生和發(fā)展中的中心地位[4],特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO對(duì)維持心血管系統(tǒng)的正常生理功能具有積極的作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察淫羊藿苷對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外分泌NO功能的調(diào)控作用,旨在探討淫羊藿可能的內(nèi)皮保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 外周血取自健康成年志愿者,約40 mL,淫羊藿苷購自中國生物制品(標(biāo)準(zhǔn)品),阿托伐他汀為北京嘉林藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)為英國PeproTech公司產(chǎn)品,M199培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品,乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)和荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)購自美國Sigma公司,CD133和CD34分別為美國Ancell公司和美國BD公司產(chǎn)品,紫外可見分光光度計(jì)(UV-9100)為北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品,NO檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 淫羊藿苷溶液的制備 用DMSO溶解淫羊藿甙粉劑,配置成1 μ g/mL原始液,室溫條件下,充分震蕩10 min,超聲溶解1 min,以1 000 r/min,離心20 min后,除去沉淀物,保留上清備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 取健康成年志愿者新鮮外周血40 mL,以密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,接種于預(yù)先包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中,加入含有胎牛血清的M199培養(yǎng)基(10%胎牛血清、VEGF 10 ng/mL,青霉素100 U/mL及鏈霉素100 U/mL),在37℃5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)4 d。4 d后洗掉非貼壁細(xì)胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d。

培養(yǎng)7 d的細(xì)胞(以 0.25%胰酶消化,制成細(xì)胞懸液)分別與 Dil-acLDL(2.4 μ g/mL)和 FITC-UEA-I(10 μ g/mL)孵育 1 h,2%多聚甲醛固定,通過激光共聚焦顯微鏡鑒定,FITC-UEA-I和DiLDL雙染色陽性細(xì)胞則培養(yǎng)細(xì)胞為正在分化的EPCs。另以成熟人內(nèi)皮細(xì)胞作對(duì)照,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD133的表達(dá)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 在培養(yǎng)的第7天,洗掉非貼壁細(xì)胞,收集貼壁細(xì)胞。之后以0.25%胰酶將各孔細(xì)胞消化下來制成細(xì)胞懸液,以為1×104/cm2的接種密度接種到96孔板,隨機(jī)分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng)液)、阿托伐他汀干預(yù)組(終濃度10 μ mol/L)、不同濃度的淫羊藿甙干預(yù)組(淫羊藿甙濃度分別為10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL的條件培養(yǎng)液)。每組5個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 普通倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)期細(xì)胞的生長特點(diǎn)及形態(tài)。

1.2.5 EPCs NO含量的檢測(cè) 將培養(yǎng)7 d的細(xì)胞接種于96孔板,24 h后分別給予阿托伐他汀及不同濃度淫羊藿苷干預(yù)24 h及48 h,每孔吸取上清 100 μL,按 NO試劑盒說明,取血清樣本,配備所需試劑,按要求操作后在分光光度計(jì)550 nm波長處讀取吸光度值,按公式計(jì)算血清NO濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5分析軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料方差分析及完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料方差分析,組間資料比較采用ANOVA和 t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs的鑒定 培養(yǎng)7 d洗去不貼壁細(xì)胞及碎片后,可見典型細(xì)胞集落:中間為大量的圓形細(xì)胞,外周為紡錘形細(xì)胞。培養(yǎng)第10天熒光顯微鏡檢顯示:細(xì)胞攝取DiI-ac-LDL,顯微鏡下激發(fā)紅色熒光,細(xì)胞與FITC標(biāo)記荊豆凝集素I結(jié)合,顯微鏡下激發(fā)綠色熒光。雙染色陽性細(xì)胞呈黃色,為正在分化的EPCs。流式細(xì)胞儀示貼壁細(xì)胞表達(dá)CD 34陽性(38.36±3.70)%,CD133陽性(13.91±1.47)%,進(jìn)一步證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察可見:剛剛從外周血分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形,體積小;在培養(yǎng)的第2天細(xì)胞開始出現(xiàn)成簇現(xiàn)象;第4天細(xì)胞開始由圓形轉(zhuǎn)為梭形貼壁細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng)第7天,多數(shù)細(xì)胞呈梭形或多角形,且有集落樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。

2.3 淫羊藿苷和阿托伐他汀對(duì)EPCs的NO分泌的影響 隨著淫羊藿苷濃度的升高,EPCs培養(yǎng)上清中NO的濃度相應(yīng)升高,呈一定量效及時(shí)效關(guān)系。10 ng/mL淫羊藿苷組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),25 ng/mL、50 ng/mL淫羊藿苷組與對(duì)照組相比EPCs培養(yǎng)上清中NO濃度明顯提高(P＜0.05或P＜0.01),表明藥物具有提高培養(yǎng)液NO濃度的作用,并且隨者藥物濃度的增加效果逐漸增強(qiáng)。淫羊藿苷各濃度的作用效果均隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng)。阿托伐他汀組與對(duì)照組相比,EPCs培養(yǎng)上清中NO濃度顯著提高(P＜0.01),但不同時(shí)間NO的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),提示阿托伐他汀組作用效果隨著時(shí)間的延長沒有增強(qiáng)趨勢(shì)。不同濃度淫羊藿苷組與阿托伐他汀組同時(shí)間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)?？梢?雖然中藥淫羊藿與西藥阿托伐他汀均可促進(jìn)內(nèi)皮組細(xì)胞分泌NO,但阿托伐他汀作用較為顯著。詳見表1。

表1 淫羊藿苷和阿托伐他汀對(duì)EPC的 NO分泌的影響(±s)

表1 淫羊藿苷和阿托伐他汀對(duì)EPC的 NO分泌的影響(±s)

組別 劑量 24 h 48 h淫羊藿苷組 10 ng/mL 66.599±4.495 111.695±17.857 25 ng/mL 92.491±12.5971)4)127.950±16.1921)3)50 ng/mL 134.576±10.2752)3)157.746±17.9682)3)對(duì)照組 50.068±5.085 60.339±5.130阿托伐他汀組 10 μ mol/L 165.017±14.4852) 169.525±5.9822)與對(duì)照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與阿托伐他汀組同時(shí)間比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01

3 討 論

淫羊藿是中國傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明,淫羊藿有效成分為淫羊藿苷,其具有廣泛的生理活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以淫羊藿苷為主要成分的制劑對(duì)心腦血管系統(tǒng)、骨代謝、免疫系統(tǒng)等方面具有廣泛的藥理功效[5]。中醫(yī)理論中《素問?逆調(diào)論》:“腎者水臟,主津液”,如果腎臟虛損、腎虛精虧一則水不涵木,肝失所養(yǎng),疏泄失常,膏脂布化障礙;二則腎陽虛失于溫煦,致脾陽不振,脾土運(yùn)化失調(diào),痰濁內(nèi)生而發(fā)病[6]。腎功能異常,則津液代謝失常,膏脂不運(yùn)阻于血管則會(huì)變生心血管疾病。研究已經(jīng)表明內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管的損失及修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用,他汀類藥是廣泛應(yīng)用于臨床的一種降脂藥,最近的研究發(fā)現(xiàn)其還有很多有益的心血管保護(hù)作用,例如增加NO生物利用率、促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊等[7]。

NO是體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子。目前研究認(rèn)為作為一種新型生物信息分子NO是一種能透過細(xì)胞膜擴(kuò)散的自由基礎(chǔ)。它與某些含氮衍生物一起通過和生物信息分子的相互作用參與機(jī)體保護(hù)、調(diào)節(jié)及逆轉(zhuǎn)等機(jī)制,尤其參與調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)中眾多的生理和病理生理過程。由內(nèi)皮細(xì)胞所生成的NO具有多種生物學(xué)效應(yīng),NO幾乎參與了人體各個(gè)平衡狀態(tài)的維持,因此NO生物利用度的降低將直接導(dǎo)致內(nèi)皮功能的損傷,這可以表現(xiàn)為[8-10]血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的減弱、血小板聚集的增加、白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、血管平滑肌增生等,目前對(duì)于NO的研究中心已經(jīng)從基礎(chǔ)理論研究逐漸向應(yīng)用方面過渡[11,12],主要開發(fā)NO供體型藥物,己有一些研究成果問世。研究發(fā)現(xiàn)一些中藥對(duì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO合成和釋放具有良好的效果[13]。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)隨著淫羊藿苷濃度的提高,EPCs培養(yǎng)上清中NO的濃度相應(yīng)升高,呈明顯的量效關(guān)系;且48 h較24 h作用效果明顯增強(qiáng),呈明顯的時(shí)效關(guān)系。提示淫羊藿苷可以提高人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞NO的分泌,且呈一定的量效及時(shí)效關(guān)系,為淫羊藿的血管內(nèi)皮保護(hù)作用、有效防治心腦血管疾病提供了科研依據(jù)。本研究表明,淫羊藿具有一定的促進(jìn)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞NO分泌的內(nèi)皮保護(hù)作用機(jī)制,但淫羊藿防治動(dòng)脈粥樣硬化,治療心血管疾病的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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