李 巖,王宏敏,李 明,高智群,鄺棗園

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一[1]。利用我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源開發(fā)抗AS藥物,為AS的臨床治療開辟新途徑具有重要的研究意義和實(shí)用價(jià)值。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗感染作用的清熱解毒代表方藥黃連解毒湯具有抗 AS作用,但對于其作用機(jī)制尚不完全清楚[2]。

細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等表面,在正常情況下僅微弱表達(dá)。氧化型低密度脂蛋白、細(xì)菌及其脂多糖(LPS)和炎癥因子等AS危險(xiǎn)因素可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1,介導(dǎo)單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞和游走至內(nèi)皮下,分化為巨噬細(xì)胞,吞噬脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞。因此,ICAM-1在AS的發(fā)生中具有重要作用[3]。本研究采用LPS刺激人內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304為模型,觀察黃連解毒湯中黃芩的主要活性成分之一黃芩素對ICAM-1表達(dá)的影響,從對黏附分子的影響角度初步探討黃連解毒湯可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 黃芩素(上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心,含量98%);細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS,Sigma公司);Trizol(Invitrogen公司);兩步法RT-PCR試劑盒、引物(Takara公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce公司);抗抑制蛋白κ B(I-κ B)p65 和β-Actin 抗體(Santa Cruze公司)。PCR儀(Perkinelmer公司);紫外凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、雜交箱和酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)實(shí)驗(yàn) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304細(xì)胞為由本室保存。用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μ g/mL鏈霉素)傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的ECV-304細(xì)胞接種到12孔培養(yǎng)板內(nèi),待細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)后,用PBS清洗2次,更換培養(yǎng)液,按照分組分別加入PBS或不同濃度的黃芩素(終濃度分別為 1 μ mol/L、10 μ mol/L、5 0 μ mol/L)孵育1 h,然后加入LPS(終濃度1 μ g/mL)進(jìn)行刺激。實(shí)驗(yàn)分組如下:正常對照組、黃芩素組、LPS組和黃芩素加LPS組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-PCR檢測ICAM-1 mRNA的表達(dá) 各組細(xì)胞加入相應(yīng)刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)8 h,用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度計(jì)測定A260/A280為1.8～2.0。以總RNA為模板,用Oligo-d(T)18為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,特異性引物分別擴(kuò)增ICAM-1和β-Actin。ICAM-1引物序列如下,Sense:5'-CCG AGC TCA AGT GTC TAA AG-3',Antisense:5'-TGC CAC CAA TAT GGG AAG GC-3',擴(kuò)增長度369bp;β-Actin引物序列如下,Sense:5'-TGA ACC CT A AGG CCA ACC-3',Antisense:5'-CCA CAG GAT TCC ATA CCC-

3',擴(kuò)增長度489bp。PCR條件為94℃預(yù)變性4 min,然后94℃變性45 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環(huán)30次,最后72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物,用Qautity One軟件分析ICAM-1與β-Actin的PCR產(chǎn)物灰度值,以二者比值來表示ICAM-1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 Western Blot 檢測 ICAM-1和I-κ B的表達(dá) ECV-304細(xì)胞加入刺激物后繼續(xù)培24 h,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取50μ g樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%的濃縮膠和 10%的分離膠),轉(zhuǎn)膜,5%的脫脂奶粉 37℃封閉1 h,加抗ICAM-1、I-κ B或β-Actin單克隆抗體稀釋液(1∶2 000),4℃孵育過夜,洗膜,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液(1∶3 000)37℃孵育1 h,ECL法顯影,Qautity One軟件分析條帶灰度值,以目的條帶與β-Actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素對ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示,在無外源性刺激的情況下內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304僅極低量表達(dá)ICAM-1,單獨(dú)加入黃芩素對其表達(dá)無顯著影響。LPS可以上調(diào)ECV-304細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá),而在LPS刺激前加入黃芩素進(jìn)行預(yù)處理,可以顯著抑制 LPS誘導(dǎo)的ICAM-1 mRNA增高。Western Blot結(jié)果同樣顯示,LPS上調(diào)ICAM-1蛋白表達(dá),黃芩素預(yù)處理抑制ICAM-1蛋白表達(dá)上調(diào)。詳見圖1、表 1。

圖1 黃芩素抑制LPS誘導(dǎo)的ECV-304細(xì)胞ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)

表1 各組ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 各組ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)比較(±s)

組別 ICAM-1 mRNA/β-Actin ICAM-1蛋白/β-Actin正常對照組 0.127±0.047 0.177±0.042黃芩素組 0.145±0.047 0.260±0.089 LPS組 1.263±0.2121) 0.993±0.1051)LPS+1 μ mol/L黃芩素組 0.977±0.1122) 0.720±0.1152)LPS+10 μ mol/L黃芩素組 0.857±0.0652) 0.490±0.1442)LPS+50 μ mol/L黃芩素組 0.687±0.1063) 0.463±0.0832)與對照組比較,1)P＜0.01;與LPS組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.2 I-κ B蛋白的檢測 Western Blot結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)下ECV-304細(xì)胞 I-κ B被降解;LPS刺激前用黃芩素預(yù)處理可抑制I-κ B降解,上調(diào)胞漿內(nèi)I-κ B含量,與 LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說明黃芩素能抑制 I-κ B降解,阻礙 LPS引起的巨噬細(xì)胞 NF-κ B信號途徑活化。詳見圖2、表2。

圖2 黃芩素抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞I-κ B蛋白降解

表2 各組I-κ B蛋白表達(dá)比較(±s)

表2 各組I-κ B蛋白表達(dá)比較(±s)

組別 I-κ B 蛋白/β-Actin正常對照組 1.093±0.110黃芩素組 0.993±0.105 LPS組 0.373±0.0711)LPS+1 μ mol/L 黃芩素組 0.483±0.0952)LPS+10 μ mol/L黃芩素組 0.573±0.0952)LPS+50 μ mol/L黃芩素組 0.860±0.0892)與對照組比較,1)P＜0.01;與LPS組比較,2)P＜0.05

3 討 論

AS是各種致病因子造成血管內(nèi)皮損傷,導(dǎo)致單核細(xì)胞黏附和侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞,分泌多種炎癥因子而引起的一種慢性炎癥性反應(yīng)[4]。其中,單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,繼而穿越內(nèi)皮細(xì)胞層進(jìn)入內(nèi)皮下是AS形成的早期事件之一,其過程主要由細(xì)胞黏附分子參與[5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子ICAM-1可以和單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞膜上的相關(guān)受體結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附,并促使單核細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下分化為巨噬細(xì)胞,進(jìn)一步吞噬脂質(zhì)最終變?yōu)榕菽?xì)胞[6];此外,ICAM-1還可以介導(dǎo)淋巴細(xì)胞在炎癥局部的集聚,進(jìn)一步促進(jìn)AS的慢性炎癥反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)敲除ICAM-1基因可以減小動物AS斑塊面積[7],因此,ICAM-1介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附在 AS發(fā)生中具有重要作用。ICAM-1的誘導(dǎo)性表達(dá)與刺激物激活NF-κ B信號途徑相關(guān)[8]。NF-κ B在無外界刺激情況下與抑制蛋白I-κ B結(jié)合,以無活性三聚體形式存在于細(xì)胞漿。外界刺激物激活 I-κ B激酶降解 I-κ B,使 NF-κ B活化進(jìn)入細(xì)胞核,引起ICAM-1和其他炎癥因子的表達(dá)。本研究結(jié)果證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞在無刺激情況下極低量表達(dá)ICAM-1,LPS刺激可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞 I-κ B降解,上調(diào) ICAM-1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),與Chen等[9]研究結(jié)果一致。

黃連解毒湯為唐代王燾所著《外臺秘要》中所收載的清熱解毒的代表方劑,由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成,功能清熱燥濕、瀉火解毒。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯能減輕兔AS斑塊病變程度,縮小斑塊面積[2],Sekiya也得到了類似的研究結(jié)果[10]。但由于黃連解毒湯成分復(fù)雜,難以對其機(jī)制詳細(xì)研究,因此本實(shí)驗(yàn)采用黃芩的主要有效成分黃芩素,從單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附入手,觀察黃芩素對黏附分子ICAM-1表達(dá)的影響,初步探討黃連解毒湯抗AS的可能作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,黃芩素在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平都可以抑制LPS誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá),其作用機(jī)制可能與抑制I-κ B降解,進(jìn)而阻斷NF-κ B通路活化有關(guān)。因此,推測抑制ICAM-1表達(dá)可能是黃連解毒湯抗 AS的作用機(jī)制之一。由于 NF-κ B通路同時(shí)介導(dǎo)了其他炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)的表達(dá),推測黃芩素也可以抑制這些炎癥因子的表達(dá),通過抗炎機(jī)制抑制AS斑塊的形成。

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