王 穎 馬海樂

隨著啤酒工業(yè)迅速發(fā)展，啤酒糟作為啤酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物其產(chǎn)生量也在增加。啤酒糟中固形物含量一般為15%～25%，水分含量高，極易腐敗變質(zhì)，但干糟中含粗蛋白35%～51%，加以開發(fā)也是一種很好的飼料蛋白來源。目前國內(nèi)多數(shù)啤酒生產(chǎn)企業(yè)將啤酒糟直接出售用作飼料，這種飼料中的非蛋白氮和無機氮不能被飼養(yǎng)動物有效利用，纖維素也阻礙了營養(yǎng)成分的吸收，由于含水量較高，很難貯藏，一旦滯銷很容易霉爛、腐敗而影響環(huán)境。利用固態(tài)發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化啤酒糟可以將其成分改性，很多研究表明利用發(fā)酵方法可以有效提高啤酒糟蛋白質(zhì)含量。

在混菌發(fā)酵啤酒糟的過程中，微生物和發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)發(fā)生著復雜的物理、化學和生物以及物質(zhì)和能量的傳遞。在周圍復雜的外界條件中，影響啤酒糟固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蛋白飼料的因素較多。本研究以啤酒糟為主要原料，以培養(yǎng)一段時間的枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌的豆粕培養(yǎng)液為菌種，以接種量、發(fā)酵時間、尿素添加量以及硫酸銨添加量等為因素建立正交試驗進行優(yōu)選，生產(chǎn)出蛋白氮含量高的活性飼料。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：啤酒濕糟，鎮(zhèn)江天目湖啤酒有限公司提供，干糟中真蛋白含量約為21%；豆粕，用錘片式粉碎機粉碎，過60目篩，丹陽市正大油脂有限公司提供。

菌種：枯草芽孢桿菌M5094、熱帶假絲酵母C3161，由常州新區(qū)三環(huán)生物工程成套設備有限公司提供。

主要培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基(培養(yǎng)酵母用)和LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)枯草芽孢桿菌用)；液體種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基 (培養(yǎng)酵母用)和LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)枯草芽孢桿菌用)。

1.2 發(fā)酵處理方法

混菌豆粕培養(yǎng)液制備：挑取枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌各一環(huán)接入相應的液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)1 d后接入滅菌的豆粕培養(yǎng)液中，豆粕培養(yǎng)液成分為豆粕15 g，葡萄糖添加量1 g，自來水85 ml，pH值4.5。

啤酒糟發(fā)酵：將生長3 d的混菌豆粕培養(yǎng)液接入啤酒糟培養(yǎng)基?？疾旎A培養(yǎng)基成分、接種量、硫酸銨添加量和尿素添加量對發(fā)酵產(chǎn)品真蛋白的影響。

1.3 發(fā)酵產(chǎn)品真蛋白測定方法

發(fā)酵產(chǎn)物在60℃下烘干后粉碎，準確稱取試樣1～2 g置于250 ml燒杯中，加蒸餾水50 ml煮沸30 min。依次加入10%硫酸銅水溶液20 ml和2.5%氫氧化鈉溶液20 ml，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌幾分鐘。放置2 h或靜置過夜，沉淀物以中速定量濾紙過濾。用70℃以上熱水反復洗滌沉淀，直至濾液無沉淀為止(取氯化鋇試液滴于表面皿中，加2 mol/l鹽酸溶液1滴，滴入濾液，在黑色背景下觀察應無白色沉淀)。然后，將濾紙和沉淀物包好，放人烘箱中在65～70℃下干燥2 h。

將濾紙與沉淀物一起放入凱式燒瓶中，消化后用凱式定氮法測定樣品中真蛋白含量，同時做空白對照(對應加入一塊濾紙消化)。

2 結果與討論

2.1 啤酒糟與豆粕配比的選擇

試驗用啤酒糟含水量為75%，含水量較多，而豆粕粉含水量為9%，在啤酒糟中添加適宜的豆粕粉，可以吸收濕糟多余的水分，同時提高發(fā)酵物營養(yǎng)成分。試驗選擇啤酒糟與豆粕粉配比分別為：9：1、8：2、7： 3、6： 4。其中 9： 1、8： 2 配比時豆粕不能完全吸收酒糟的水分，混合物底層有滲下來的水分；而6：4配比時豆粕添加量稍多，混合物底層有未吸附水分的豆粕；7：3配比最適，豆粕粉可與啤酒糟均勻混合。本試驗選擇啤酒糟與豆粕配比為7：3。

2.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見圖1）

試驗設置為：基質(zhì)培養(yǎng)基成分為啤酒糟70%、豆粕粉 30%；發(fā)酵時間選擇 1、2、3、4、5、6 d；接種量20%；50 g基質(zhì)培養(yǎng)基放入250 ml的藍蓋瓶內(nèi)，置于28℃培養(yǎng)。

圖1 發(fā)酵時間對真蛋白含量的影響

由圖1可見，在發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)品中真蛋白含量先增加，之后逐步降低，當發(fā)酵時間為2 d時，產(chǎn)品中真蛋白含量最高。故此時應停止發(fā)酵，如繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量會因微生物的自溶而下降。在工業(yè)化生產(chǎn)中，發(fā)酵周期過長，還可能造成雜菌污染，影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，增加生產(chǎn)成本，故發(fā)酵時間以2 d左右為宜。

2.3 接種量對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見圖2）

試驗設置為：發(fā)酵時間為2 d；接種量選擇10%、20%、30%、40%、50%；基礎培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同上。

圖2 接種量對產(chǎn)品真蛋白含量的影響

由圖2可見，隨著接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量先增高再下降，當接種量為20%時，發(fā)酵產(chǎn)品中真蛋白含量最高，當繼續(xù)增加接種量時，真蛋白含量反而下降，這主要是由于接種量過大，雖使發(fā)酵周期縮短，菌體生長速度加快，但菌絲易老化，且發(fā)酵中的營養(yǎng)物質(zhì)更多的消耗在菌體生長上，故產(chǎn)品中真蛋白的含量呈現(xiàn)下降趨勢。

2.4 硫酸銨添加量對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見圖3）

試驗設置為：接種量20%；硫酸銨添加量選擇0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；發(fā)酵時間、基礎培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同上。由圖3可以看出，添加硫酸銨混菌發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量明顯提高，但當添加量達到0.5%以后，繼續(xù)添加硫酸銨，產(chǎn)物真蛋白質(zhì)含量不再增加。所以選擇0.5%為最佳硫酸銨添加量。

圖3 不同濃度的硫酸銨對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量的影響

2.5 尿素添加量對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響（見圖4）

試驗設置為：硫酸銨添加量為0.5%；尿素添加量選擇 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；接種量、發(fā)酵時間、基礎培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同上。

圖4 不同濃度的尿素對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可以看出，尿素對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量的作用規(guī)律與硫酸銨相似。添加尿素混菌發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量明顯提高，隨著尿素添加量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量相應增高，但當添加量增加到1%以后，繼續(xù)添加尿素，產(chǎn)物真蛋白含量不再增加。而且，氮源添加量濃度過高，產(chǎn)品有較刺鼻的氨味，產(chǎn)品風味變差。

由圖3和圖4可見，混菌固態(tài)發(fā)酵過程中對于超過1.0%高濃度的非蛋白氮源利用率較小，而且在發(fā)酵過程中對硫酸銨和尿素的利用能力都較好，此結果與張福元研究結論一致。

2.6 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以發(fā)酵時間、接種量、硫酸銨添加量和尿素添加量為試驗因子，進行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗。以酒糟發(fā)酵過程中產(chǎn)品真蛋白含量為考察指標。試驗安排、試驗結果及試驗分析如表1、2、3 所示。

表1 正交試驗L9(34)影響因素及水平

由表2可知，極差分析所得最優(yōu)展望組合為A1B2C1D2，按照極差大小，影響啤酒糟發(fā)酵過程中產(chǎn)品真蛋白含量的4個因素的主次順序依次為A>B>D>C，即培養(yǎng)天數(shù)、接種量、硫酸銨添加量、尿素添加量。經(jīng)方差分析(見表3)可知，發(fā)酵時間對啤酒糟發(fā)酵過程中產(chǎn)品真蛋白含量有顯著性影響。

表2 L9(34)正交試驗直觀分析

表3 正交試驗方差分析

因最優(yōu)展望組合A1B2C1D2未在正交表中，所以對該展望組合進行驗證試驗。采用3個批次，每批3個平行樣，測量結果真蛋白平均值為39.13%，高于正交表中的最大值38.49%，由此，確定組合A1B2C1D2為本試驗最優(yōu)反應條件，即最佳發(fā)酵條件為啤酒糟與豆粕粉混合比例為7：3，硫酸銨添加量為0.5%，尿素添加量為0.5%，混菌豆粕培養(yǎng)液接入量為20%，發(fā)酵時間為1 d。

3 結論

(1)通過啤酒糟和豆粕粉的合理配比，可以利用豆粕吸附酒糟中過多的水分，達到適宜的固態(tài)發(fā)酵含水量，可節(jié)省工業(yè)步驟，簡化操作過程。

(2)混菌發(fā)酵啤酒糟可明顯提高啤酒糟中的蛋白含量，提高啤酒糟的營養(yǎng)。真蛋白可提高到39.13%。

(3)發(fā)酵天數(shù)是發(fā)酵的主要因素，經(jīng)過優(yōu)化試驗，測得最優(yōu)工藝條件為：啤酒糟與豆粕粉混合比例為7：3，硫酸銨添加量為0.5%，尿素添加量為0.5%，混菌豆粕培養(yǎng)液接入量為20%，發(fā)酵時間為1 d。

若干篇，刊略，需者可函索）