喹唑啉酮類化合物是一類具有藥效的小分子，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值。喹唑啉酮類化合物具有多種生理活性，主要表現(xiàn)在對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)或酪氨酸激酶(EGFR.TK)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGFR)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)及其它多個(gè)作用靶點(diǎn)的抑制活性，從而發(fā)揮抗癌、抗菌、抗病毒等多種藥理作用，引起了人們廣泛的研究興趣。3-(2-羥乙基)-2-對(duì)甲苯胺基喹唑啉-4(3-H)-酮(HTQ)作為喹唑啉酮類化合物的一種衍生物可以預(yù)見(jiàn)有很好的生物活性[1]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 HTQ的結(jié)構(gòu)式

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)最重要的一類生物大分子，藥物進(jìn)入人體后需要通過(guò)血漿的儲(chǔ)運(yùn)才能發(fā)生藥理作用，血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白。通過(guò)測(cè)定血清白蛋白的變化，可為疾病診斷、療效觀察提供有價(jià)值的資料及數(shù)據(jù)。因此，從不同角度研究以白蛋白為代表的蛋白質(zhì)與具有生物活性的小分子間的相互作用，從而了解藥物的作用機(jī)制，已成研究熱點(diǎn)。

活性小分子與血清白蛋白相互作用的研究是介于化學(xué)與生命科學(xué)之間的邊緣性課題，采用的研究方法有熒光法、紫外光譜法和色譜法等，其中熒光法研究藥物活性小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)不僅靈敏度高，而且可以綜合利用蛋白質(zhì)和活性小分子的熒光猝滅、能量轉(zhuǎn)移和實(shí)驗(yàn)條件的影響等方面的信息，因而是主要的研究手段[2]。作者在此應(yīng)用熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了HTQ與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，包括結(jié)合位置、結(jié)合常數(shù)、作用力類型、共存物質(zhì)的影響以及藥物在血液中的分配等。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

HTQ由咸寧學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院有機(jī)合成實(shí)驗(yàn)室提供；BSA溶解在Tris-HCl緩沖溶液中，實(shí)驗(yàn)前15 min配制BSA溶液；Tris(生化試劑)；濃鹽酸；NaCl；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次亞沸水。

帶恒溫槽系統(tǒng)的F-4500型熒光分光光度計(jì)、UV-2300型可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本日立公司；BS-120型電子分析天平(d=0.0001)；PHS-3C型數(shù)字式酸度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

蛋白質(zhì)溶液的配制：分別稱取0.0355 g BSA溶于Tris-HCl緩沖溶液中,配制50 mL不同溫度(T=298 K、302 K、306 K、310 K)下pH值7.4的1×10-5mol·L-1BSA溶液。

猝滅劑的配制：稱取0.0012 g HTQ溶于2 mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，配制成濃度為2×10-3mol·L-1的HTQ溶液。

在2 cm比色皿中分別加入2 mL 1×10-5mol·L-1的BSA溶液和不同量的2×10-3mol·L-1HTQ溶液，得不同摩爾比的BSA-HTQ系列溶液。

1.2.2 紫外吸收光譜分析

測(cè)定摩爾比為1∶1的BSA-HTQ溶液的紫外吸收光譜。

1.2.3 熒光光譜分析

測(cè)定各溶液在不同溫度下的熒光光譜。激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm,以λex=295 nm激發(fā),在300～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描并繪制不同濃度HTQ溶液對(duì)BSA的熒光猝滅光譜。分別固定Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm掃描其同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 HTQ對(duì)BSA的熒光猝滅

HTQ作為熒光猝滅劑，在與BSA結(jié)合的過(guò)程中，能不同程度地猝滅BSA的熒光強(qiáng)度。固定BSA濃度為1×10-5mol·L-1，向其中分次(每次2 μL，共7次)加入2×10-3mol·L-1的HTQ溶液，測(cè)定各次BSA的熒光光譜，結(jié)果見(jiàn)圖2。

a～h.HTQ用量(μL)：0,2,4,6,8,10,12,14

由圖2可以看出，隨著HTQ濃度的增大，BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低。由于HTQ分子本身在λ=367 nm附近沒(méi)有熒光峰，故HTQ不會(huì)發(fā)生與BSA相互干擾的熒光，因此，HTQ對(duì)BSA的熒光有猝滅作用。

2.2 猝滅機(jī)理的推斷

熒光被猝滅的原因有三種：動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移。熒光猝滅過(guò)程通常可以分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子發(fā)生作用導(dǎo)致熒光猝滅的過(guò)程,其過(guò)程遵循Stern-Volmer方程[3]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中：F0、F分別為不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；KSV為Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)；Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子平均壽命(生物大分子熒光壽命約為1×10-8s )[4]；[Q]為猝滅劑(HTQ)濃度，mol·μL-1。通常各類熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1(Kq≤2.0×1010L·mol-1·s-1)[5]。

靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子的基態(tài)分子發(fā)生作用導(dǎo)致熒光猝滅的過(guò)程，靜態(tài)猝滅可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系來(lái)描述:

(2)

式中：KLB為基態(tài)配合物的生成常數(shù)。

一般情況下，動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅可依據(jù)不同溫度條件下的結(jié)果得以區(qū)別。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，溫度的升高將增加分子間的有效碰撞和加劇能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，導(dǎo)致動(dòng)態(tài)熒光猝滅常數(shù)KSV增大。對(duì)于靜態(tài)猝滅，溫度的升高將降低藥物與蛋白所形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，導(dǎo)致猝滅常數(shù)減小[6]。

分別研究了在298 K、302 K、306 K、310 K時(shí)，加入HTQ后BSA熒光強(qiáng)度的變化，并繪制BSA的Stern-Volmer曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同溫度下(F0/F)-1～[Q]關(guān)系

由圖3可知，隨著溫度的升高，KSV增大。

由線性方程求得猝滅常數(shù)KSV和相關(guān)系數(shù)，根據(jù)KSV=Kqτ0計(jì)算得到4個(gè)溫度下的猝滅速率常數(shù)Kq均小于2.0×1010L·mol-1·s-1。表明HTQ對(duì)BSA的猝滅是由于分子間碰撞而引起的動(dòng)態(tài)猝滅。

表1 HTQ對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程 以及相關(guān)的KSV

2.3 作用力類型的分析

活性小分子和生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵力、靜電引力、范德華力、疏水作用力等。不同分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合力類型是不同的。Ross等根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出判斷生物大分子與有機(jī)小分子等結(jié)合力性質(zhì)與結(jié)合作用熱力學(xué)函數(shù)之間關(guān)系的規(guī)律，根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小，可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型：ΔH>0、ΔS>0為疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0為氫鍵力和范德華力；ΔH≈0、ΔS>0為靜電引力[7]。假設(shè)在測(cè)定溫度范圍內(nèi)焓變變化不大，則它的值和熵變?chǔ)可以從Van′t Hoff 方程求得:

lnK=-ΔH/(RT)+ΔS/R

(3)

這里的K值近似于相應(yīng)溫度下Stern-Volmer方程中的猝滅常數(shù)KSV,通過(guò)lnKSV對(duì)1/T作圖(圖4),直接算出ΔHθ和ΔSθ，再由ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ可計(jì)算出ΔGθ，相關(guān)數(shù)據(jù)列于表2。

pH=7.4,c(BSA)=1×10-5 mol·L-1

表2 Stern-Volmer 動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV及相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)(pH=7.4)

由表2可知,該反應(yīng)是自發(fā)的(ΔG<0)，HTQ對(duì)BSA的作用力主要為疏水作用力(ΔH>0、ΔS>0)。

2.4 HTQ與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)

對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程,熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可由熒光分子和猝滅劑分子之間的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式推導(dǎo)求出[8]。設(shè)BSA有n個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),則其與HTQ間的猝滅反應(yīng)可表示為BSA+n[Q]=BSA[Q]n，其表觀結(jié)合常數(shù)Kb=[BSA[Q]n]/[BSA][Q]n。若熒光體總濃度為[BSA]0,則[BSA]0=[BSA[Q]n]+[BSA],當(dāng)[Q]?[BSA]0時(shí),猝滅劑的起始濃度代替其平衡濃度,則Kb=([BSA]0-[BSA])/[BSA][Q]n。

動(dòng)態(tài)猝滅中,體系的熒光強(qiáng)度F與其游離熒光體濃度成正比,將[BSA]/[BSA]0=F/F0代入上式得：

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(4)

式中：n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；Kb為表觀結(jié)合常數(shù)。繪制lg[(F0/F) - 1]～lg[Q]直線，斜率就是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n、截距就是lgKb。相關(guān)數(shù)據(jù)列于表3。

由表3可知，在接近人的生理溫度(310 K)時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)n接近1，說(shuō)明HTQ與BSA易以1∶1形成復(fù)合物，且溫度對(duì)HTQ與BSA的結(jié)合常數(shù)Kb影響較小(Kb值均在2.228×10-2～3.356×10-2L·mol-1之間),Kb平均值為2.846×10-2L·mol-1。說(shuō)明HTQ與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)所儲(chǔ)存和運(yùn)輸。

表3 不同溫度下的表觀結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

2.5 HTQ與BSA的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制以及結(jié)合距離

能量轉(zhuǎn)移作用可以發(fā)生在藥物蛋白質(zhì)復(fù)合物內(nèi)部,也可以發(fā)生在藥物與蛋白質(zhì)分子之間。在后一種情況時(shí)，利用F?rster能量轉(zhuǎn)移理論,可以求出和蛋白質(zhì)作用的藥物與色氨酸殘基之間的距離,由此推測(cè)藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的空間部位。

按F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[9]，可求得化合物HTQ結(jié)合時(shí)結(jié)合位置與蛋白質(zhì)分子中熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離:

(5)

式中：E為能量轉(zhuǎn)移效率；r為給體(BSA)和受體(HTQ)的距離；R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離，可由下式求出:

(6)

式中:K2為偶極空間取向因子;n為介質(zhì)的折射指數(shù);Ф為給體的熒光量子產(chǎn)率;J為給體的熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的光譜重疊積分，即：

(7)

式中:F(λ)為熒光給體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度;ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。

圖5為BSA與HTQ的摩爾比為1∶1時(shí)，HTQ的吸收光譜與BSA熒光發(fā)射光譜的重疊圖。

圖5 BSA的熒光發(fā)射光譜(a)和HTQ的吸收光譜(b)

將圖5的光譜重疊部分按式(7)求出J。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，取K2=2/3、n=1.36、Ф=0.15，代入式(6)可求出R0=2.69 nm；通過(guò)式(5)求出能量轉(zhuǎn)移效率E=0.84。根據(jù)R0、E的值，由式(5)算出BSA內(nèi)色氨酸殘基與HTQ的距離r=2.04 nm,符合能量轉(zhuǎn)移理論,說(shuō)明BSA與HTQ是足夠靠近(r<8 nm),其結(jié)合是通過(guò)非輻射能量轉(zhuǎn)移而促使蛋白質(zhì)的熒光猝滅。

2.6 HTQ對(duì)BSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜已經(jīng)被應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象的分析。由Δλ=15 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的熒光，由Δλ=60 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的熒光，因殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，故由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[10]。

固定BSA的濃度，逐漸增大(每次2 μL)HTQ的濃度，記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)的同步熒光光譜，結(jié)果見(jiàn)圖6。

pH=7.4;c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1，a～i(μL)：0,2,4,6,8,10,12,14,16

圖6中的最大峰為蛋白質(zhì)的熒光峰，可見(jiàn)色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)基本不變，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移(圖6兩直線所示)。表明HTQ的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化,酪氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性降低,BSA內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)有所瓦解。

BSA及BSA-HTQ體系的三維熒光光譜見(jiàn)圖7、強(qiáng)度等高線圖見(jiàn)圖8。

c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1;T=310 K

c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1

比較BSA及BSA-HTQ的三維熒光光譜特征,從峰的類別看:圖7中的兩條逐漸升高的“山脊”形峰分別對(duì)應(yīng)于圖8中的兩條“鉛筆”形紋線，它們的共同特征是λex=λem(Δλ=0)，是瑞利散射線；圖7中λem=295 nm左右的兩個(gè)“駝峰”形寬峰分別對(duì)應(yīng)于圖8中瑞利散射線右下方的“指紋”線,λem基本保持不變，這都是熒光峰的典型特征。從峰的位置看:加入HTQ后，BSA的瑞利散射峰起始位置及熒光峰位置均無(wú)明顯變化。從峰的強(qiáng)度看:加入HTQ后,瑞利散射峰的強(qiáng)度和熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度均有不同程度的降低。BSA的空間結(jié)構(gòu)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部，構(gòu)成疏水腔，HTQ分子的結(jié)合部位可能都處于這種疏水腔中，正是HTQ分子的加入導(dǎo)致了這種疏水微環(huán)境極性的改變，進(jìn)而導(dǎo)致了BSA構(gòu)象的變化[11]。

3 結(jié)論

應(yīng)用熒光光譜法、紫外吸收光譜法研究了HTQ與BSA 的相互作用。結(jié)果表明，HTQ對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)理是動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程,表觀結(jié)合常數(shù)Kb為2.846×10-2L·mol-1、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近于1，HTQ與BSA以摩爾比1∶1結(jié)合,其結(jié)合反應(yīng)主要是熵驅(qū)動(dòng),反應(yīng)中主要作用力是疏水作用力。BSA內(nèi)色氨酸殘基與化合物HTQ分子間的距離r=2.04 nm，加入HTQ后BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

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