氯吡格雷是一種新型的噻吩并四氫吡啶類衍生物，具有不可逆抑制血小板聚集的作用。臨床上使用的主要是其硫酸鹽硫酸氫氯吡格雷，可用于防治因血小板高度聚集引起的心、腦及其它動(dòng)脈的循環(huán)障礙等疾病[1]。關(guān)于硫酸氫氯吡格雷原料藥檢測(cè)方法的報(bào)道非常少。為了更有效地控制硫酸氫氯吡格雷原料藥的質(zhì)量，作者建立了測(cè)定原料藥中硫酸氫氯吡格雷及有關(guān)物質(zhì)含量的HPLC方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥、試劑與儀器

硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品(純度99.9%)、硫酸氫氯吡格雷原料藥(批號(hào)：20090401、20090402、20090403)，沈陽醫(yī)學(xué)院藥物中心；甲醇(色譜純)，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；三乙胺(分析純)。

UV200Ⅱ型高效液相色譜儀，大連依利特科學(xué)儀器有限公司；SunRun Express色譜數(shù)據(jù)工作站(EC2000)；AUY-120型電子天平，島津-上海公司。

1.2 方法[2～4]

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品25.0 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為對(duì)照品貯備液。

1.2.2 供試品溶液的配制

精密稱取硫酸氫氯吡格雷原料藥32.7 mg(約相當(dāng)于氯吡格雷25 mg)，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)(大連依利特科學(xué)儀器有限公司)；流動(dòng)相：1%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺(pH=4.0)-乙腈(25∶75)；檢測(cè)波長225 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.4 HPLC測(cè)定

精密量取測(cè)試溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄HPLC圖譜。理論板數(shù)按硫酸氫氯吡格雷峰計(jì)算不低于5000，分離度>1.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜(圖1)

由圖1可知，在1.2.3色譜條件下硫酸氫氯吡格雷樣品的保留時(shí)間為7.54 min(標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為7.56 min)，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾。

2.2 線性關(guān)系

分別精密量取對(duì)照品貯備液0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.1 mL、1.2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按1.2.3色譜條件測(cè)定峰面積分別為740.96、836.20、928.56、1020.30、111.56。以濃度為橫坐標(biāo)(x,mg· mL-1)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合線性回歸方程為y=1542.2x+2.216，R=0.9999，表明硫酸氫氯吡格雷檢測(cè)量在0.032～0.048 mg· mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 對(duì)照品(a)和樣品(b)的HPLC圖譜

2.3 溶液的穩(wěn)定性

精密量取供試品溶液1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度,搖勻。室溫放置，分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h 、6 h、8 h、12 h按1.2.3色譜條件重復(fù)進(jìn)樣。硫酸氫氯吡格雷峰面積的RSD為0.44%，表明樣品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 精密度

精密稱取同一批樣品(20090402)約32.7 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按1.2.3色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。硫酸氫氯吡格雷的平均含量為99.5%，RSD為0.42%(n=6)。表明方法的精密度良好。

2.5 重復(fù)性

精密稱取同一批樣品(20090402)約32.7 mg，連續(xù)稱定6份，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按1.2.3色譜條件平行測(cè)定6次。硫酸氫氯吡格雷的平均含量為99.6%，RSD為0.36%(n=6)。表明方法的重復(fù)性良好。

2.6 回收率

精密稱取硫酸氫氯吡格雷原料藥約26.1 mg、32.7 mg、39.2 mg各3份，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶20 min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密稱取硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品約25 mg，置25 mL量瓶中，再精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按1.2.3色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法由峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，3個(gè)濃度下平均回收率為100.0%，RSD為0.63%(n=9)。

2.7 樣品含量測(cè)定

精密稱取3批硫酸氫氯吡格雷原料藥32.7 mg(約相當(dāng)于氯吡格雷25 mg)，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1.5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取硫酸氫氯吡格雷對(duì)照品25.0 mg，同法測(cè)定。原料藥中硫酸氫氯吡格雷含量見表2。

表2 原料藥中硫酸氫氯吡格雷及有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

2.8 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

精密稱取硫酸氫氯吡格雷原料藥適量，加甲醇溶解并稀釋制成2 mg·mL-1的溶液作為供試品；精密量取供試品溶液適量，加流動(dòng)相稀釋成20 μg·mL-1的溶液作為對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰的峰高約為記錄儀滿量程的20%～25%，記錄色譜圖；再精密量取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積和，不得大于對(duì)照溶液主成分的峰面積。原料藥中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果見表2。

2.9 流動(dòng)相的優(yōu)化

考察了流動(dòng)相中乙腈與三乙胺配比對(duì)硫酸氫氯吡格雷出峰時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)增大乙腈比例有利于縮短保留時(shí)間，當(dāng)三乙胺∶乙腈為25∶75時(shí)，保留時(shí)間在8 min左右，能滿足含量測(cè)定的快速要求。同時(shí)考察了流動(dòng)相pH值對(duì)拖尾因子的影響，發(fā)現(xiàn)減小pH值有利于消除拖尾，這可能是因?yàn)樗嵝詶l件可抑制組分的解離，增大中性分子存在的幾率，增加組分在固定相中的溶解度，從而減少拖尾。當(dāng)pH=4.0時(shí)，拖尾因子在0.95～1.00之間。因此，選擇流動(dòng)相為1%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺(pH=4.0)-乙腈(25∶75)。

3 結(jié)論

建立了測(cè)定原料藥中硫酸氫氯吡格雷及有關(guān)物質(zhì)含量的HPLC方法。色譜柱為SinoChrom ODS-BP(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為1%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺(pH=4.0)-乙腈(25∶75)，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長225 nm，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果表明，硫酸氫氯吡格雷在0.032～0.048 mg· mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系(R=0.9999)，平均回收率為100.0%，RSD為0.63%(n=9)。該法操作簡便、靈敏、準(zhǔn)確度高，可用于硫酸氫氯吡格雷原料藥的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

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