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杉木木質(zhì)素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

2010-06-04 09:43童再康黃華宏林二培程龍軍
浙江林業(yè)科技 2010年6期
關(guān)鍵詞:瓊脂糖木質(zhì)素杉木

陳 喜,童再康,黃華宏,林二培,程龍軍

(浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 臨安 311300)

木質(zhì)素(lignin)是一種由肉桂醇等單體聚合而成的酚類多聚體,是維管植物細(xì)胞壁的重要組成成分,在木材植物中含量較高,一般約占干重的15% ~ 35%,為地球上僅次于纖維素的有機(jī)組分[1]。木質(zhì)素的生物合成是在一系列酶催化下使苯丙氨酸或酪氨酸逐步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素單體,最終聚合成木質(zhì)素的過(guò)程。肉桂酰CoA還原酶(Cinnamyol Co-A Reductase,CCR)是影響木質(zhì)素合成的一個(gè)關(guān)鍵酶,負(fù)責(zé)將各種羥基肉桂?!o酶A(CoA)酯最終還原成各種木質(zhì)素單體,對(duì)木質(zhì)素的合成與代謝也起關(guān)鍵作用。木質(zhì)素總含量和單體組成對(duì)植物體的最終用途起著決定性作用。CCR基因除了影響木質(zhì)素合成,還影響木材的微纖夾角(Microfibral Angle,mfa或MFA),進(jìn)而導(dǎo)致材質(zhì)密度和硬度的變異[2],因此對(duì)CCR基因進(jìn)行克隆和研究具有重要的實(shí)際意義[3~4]。

杉木(Cunninghamia lanceolata)屬杉科(Taxodiaceae)杉木屬(Cunninghamia),是我國(guó)特有的常綠針葉樹種之一。杉木生長(zhǎng)快,木材紋理直,結(jié)構(gòu)細(xì),耐腐力強(qiáng),用途廣泛,又因其萌芽力強(qiáng),成林迅速,故成為重要的商品用材和造林樹種。建國(guó)后,我國(guó)加強(qiáng)了杉木科研工作,并取得了重要和豐碩成果[5~8],涉及杉木森林培育、經(jīng)營(yíng)、遺傳育種、計(jì)測(cè)、木材加工利用等領(lǐng)域[9~11],其中杉木遺傳改良研究最為活躍,研究成果及報(bào)道文獻(xiàn)最多。

對(duì)杉木的CCR基因進(jìn)行克隆,并與近緣屬樹種進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)CCR基因變異情況,以期為杉木育種、遺傳進(jìn)化及轉(zhuǎn)基因研究提供基礎(chǔ)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。本文應(yīng)用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)等分子生物學(xué)方法,獲得杉木木質(zhì)素生物合成酶CCR基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為CCR的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 杉木材料采集于浙江林學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)基地杉木種子園內(nèi)。樣品采集后,直接于液氮速凍,帶回實(shí)驗(yàn)室,用于mRNA的提取。

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、克隆載體均購(gòu)自TaKaRa公司;RACE試劑盒購(gòu)自Clontech公司;其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純;宿主菌為E.coli DH5α,為本實(shí)驗(yàn)室保存。測(cè)序由南京金思特公司完成。

1.2 方法

1.2.1 杉木RNA的提取 參考相關(guān)的文獻(xiàn),采用改良的CTAB法進(jìn)行提取[12~16],具體方法如下:取1 g杉木莖和葉,液氮研磨后用藥匙將粉末加入到65℃水浴的700μL提取液中,用手搖動(dòng)混勻。然后65℃水浴20 min后冷卻至室溫。加等體積(700μL)的氯仿/異戊醇(24:1),混勻,10 000 r/min,4℃離心10 min。小心吸取上清液,重復(fù)上述步驟,直至中間層無(wú)白色絮狀沉淀。吸取上清液,加1/4體積的10M LiCl混合,4℃沉淀過(guò)夜,然后10 000 r/min離心20 min。棄上清液,用500μL SSTE溶解沉淀,加等體積氯仿/異戊醇混勻(24:1),10 000 r/min,4℃離心10 min。離心吸取上清液,加2倍體積的無(wú)水乙醇,-70℃沉淀至少30 min,或-20℃下沉淀2 h。12 000 r/min,4℃,離心20 min,去上清液,用75%的乙醇洗2次12 000 r/min,4℃離心5 min,小心棄上清液,吹干沉淀。用40μL DEPC處理的水溶解沉淀,得到RNA樣品。

1.2.2 CCR基因cDNA部分序列的克隆 cDNA合成:按照反轉(zhuǎn)錄TaKaRa PrimscriptTM RT-PCR Kit試劑盒(TaKaRa)的說(shuō)明進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲取cDNA。

1.2.2.1 RT-PCR擴(kuò)增 ①引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中各種植物的CCR基因的核酸序列進(jìn)行同源性比較,找出保守的區(qū)段,依據(jù)同源性高和簡(jiǎn)并性低的原則,設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物:

引物由上海生工合成;②進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為20μL體系,其中cDNA 2μL,10×PCR buffer 2 μL,2.5 mM dNTP Mixture 0.8μL,5 U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.1μL,10μM Forward Primer 0.2μL,10μM Reverse Primer 0.2μL,ddH2O14.7μL。擴(kuò)增條件采用Touchdown PCR進(jìn)行,反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,54℃ 30 s,72℃延伸1 min,共14個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)下降1℃;94℃變性30 s,54℃ 30s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將回收產(chǎn)物進(jìn)行目的片斷的克隆和重組子篩選,并將目的基因片段測(cè)序鑒定。

1.2.3 杉木CCR基因cDNA片段3’端和5’端的擴(kuò)增 RACE采用BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences Clontech),方法按照說(shuō)明書再稍加改良。①RACE引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增。反應(yīng)利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異引物 GSP1:5’>TGCTGGCATTGATGGCAGATGCAG<3’,用于 3’-RACE;GSP2:5’>GGTACGCCGTGTGGTGTTTACATCT < 3’,用于5’-RACE。按Clontech Smart RACE試劑盒說(shuō)明操作,首先制備RACE-cDNA,然后進(jìn)行RACE-PCR。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。②RACE產(chǎn)物的克隆測(cè)序和cDNA全長(zhǎng)獲得。3’RACE產(chǎn)物、5’RACE產(chǎn)物分別用pGEM-T載體連接,經(jīng)Amp抗性篩選、X-gal/IPTG藍(lán)白斑顯色篩選、重組質(zhì)粒酶切鑒定后,送生物技術(shù)公司測(cè)序。將3’RACE產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果和5’RACE產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果拼接為杉木CCR基因全長(zhǎng)cDNA序列,將此cDNA序列GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核苷酸同源性比較分析。利用DNA-STAR軟件分析測(cè)序結(jié)果的序列與拼接結(jié)果的序列,最終將所得到的序列在NCBI的Blast進(jìn)行比對(duì),核苷酸序列的相似性比對(duì)在NCBI的Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn)中分析,并確定開放閱讀框分析(ORF),將其推導(dǎo)相應(yīng)的氨基酸序列。蛋白質(zhì)氨基酸相似性比對(duì)在NCBI的Blastp中分析;同樣,運(yùn)用Mega3.0軟件對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列與已知報(bào)道植物推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木次生木質(zhì)部總RNA的提取

采用CTAB-LiCl法提取杉木次生木質(zhì)部總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),測(cè)得結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出,提取的RNA質(zhì)量較好,測(cè)定OD260/280為1.87,無(wú)DNA污染、無(wú)降解,具有清晰的兩條帶,分別是總RNA的28SrRNA和18SrRNA。說(shuō)明提取的總RNA純度較高,可以用于雙鏈cDNA的合成。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增

以杉木次生木質(zhì)部cDNA為模板,以CCR-D-U、CCR-D-L為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后觀察(圖2),在750 bp處有一條亮帶,450 bp處有一條較淺的帶,分別將2條帶切膠回收后,克隆出長(zhǎng)約750 bp的片段。

圖1 杉木總RNA的瓊脂糖凝膠電泳分析Figure l Electrophoretic analysis of total RNA isolated from C. lancoealata

圖2 杉木CCR cDNA RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析鑒定Figure 2 Identification of the RT-PCR product of C. lancoealata CCR cDNA by DNA agar gel electrophoresis

2.3 RACE產(chǎn)物的分析

利用擴(kuò)增出的杉木CCR部分序列設(shè)計(jì)5’端RACE特異引物GSP1和3’端RACE特異引物GSP2,分別用于基因5’端和3’端序列的擴(kuò)增。經(jīng)5’和3’RACE分別獲得大小約為800 bp和1 100 bp的PCR產(chǎn)物(圖3),克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn),5’和3’端序列與已獲得的杉木CCR編碼序列有重疊,為CCR基因mRNA的5’和3’端序列,3個(gè)序列經(jīng)軟件拼接,得到杉木CCR基因完整的cDNA序列,共1 379 bp。然后以拼接得到的CCR全長(zhǎng)cDNA設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增,凝膠電泳分析(圖4)、測(cè)序,也驗(yàn)證了所獲基因的準(zhǔn)確性。

2.4 生物信息學(xué)分析

2.4.1 杉木CCR基因cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列的分析 對(duì)測(cè)序所得到的5’RACE、3’RACE cDNA及中間核苷酸序列進(jìn)行拼接,得到杉木CCR的全長(zhǎng)cDNA,其長(zhǎng)度為1 379 bp,該序列的5’端存在57 bp的非翻譯區(qū)(UTR),其中975 bp的開放閱讀框(ORF),3’端非翻譯區(qū)(UTR)長(zhǎng)度為347 bp,其中包括38 bppoly(A)尾巴,該基因編碼324個(gè)氨基酸的蛋白(圖5),分子量約為35.71 KD,等電點(diǎn)為6.164。將此cDNA全長(zhǎng)序列在NCBI上用BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果表明:該全長(zhǎng)序列與己知的松科植物歐洲云杉(Picea abies, AM260972.1)肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因有83%的最高相似性,與火炬松(Pinus taeda, AY064169.1)、馬尾松(P.massoniana, EU753854.2)等植物的肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因具有82%的較高相似性,表明了所克隆基因確為杉木的肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因。

圖3 杉木CCR基因cDNA 5’,3’RACE產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析鑒定Figure 2 Identification of the 5’,3’ RACE product of C.lancoealata CCR cDNA by DNA agrose gel electrophore

圖4 杉木CCR全長(zhǎng)cDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳分析鑒定Figure 4 Identification of the PCR product of C. lancoealata CCR full-length cDNA by DNA agar gel

圖5 杉木CCR基因cDNA全長(zhǎng)的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 5 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the CLCCR full-length cDNA

2.4.2 杉木CCR基因核苷酸序列與推導(dǎo)的氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 將推測(cè)的杉木CCR基因編碼的324個(gè)氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行Blast結(jié)果表明:該CCR氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中其它植物的CCR氨基酸序列有高度相似性,其中與己知松科植物的歐洲云杉(CAK18610.1)、馬尾松(ACE76870.3)、火炬松(AAL47684.1)CCR基因氨基酸序列分別具有 87%、84%、84%的相似性;與其他的被子植物如樺木科的光皮樺(Betula luminifera)、楊柳科的楊樹(Populus canadensis)、桃金娘科的桉樹(Eucalyptus robusta)、茄科的有絲茄(Solanum lycopersicum)等的CCR基因氨基酸序列,也有較高的相似性。這表明所克隆基因?yàn)樯寄镜腃CR基因。多序列比對(duì)結(jié)果也進(jìn)一步表明(圖6),杉木CCR蛋白氨基酸序列與其它高等植物的CCR蛋白氨基酸序列在系統(tǒng)進(jìn)化上具有高度保守性。

將CCR基因推導(dǎo)的酶蛋白氨基酸序列與其他植物已報(bào)道的相應(yīng)序列用MAGA3.0軟件進(jìn)行多序列比較,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 7)。結(jié)果顯示:杉木與松科植物歐洲云杉、馬尾松、火炬松聚為一類,同源性較高,表明同為裸子植物的杉科植物與松科植物在進(jìn)化上有較近的親緣關(guān)系;與模式植物十字花科的擬南芥(Arabidopsis thaliana)以及禾本科植物的水稻(Oryza Sativa)、玉米(Zea Mays)、高粱(Sorghum bicolor)、小麥(Triticum aestivum)同源性次之,但不聚為一類;與楊柳科的楊樹、樺木科的光皮樺、豆科的大豆、葡萄科的葡萄(Vitis vinifera)同源性相對(duì)較低,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 杉木CCR氨基酸序列與其他植物的CCR氨基酸序列的多重比較Figure 6 Multiple comparisons of the deduced amino acid sequences of CCR from C. lanceolata and from other plant

圖7 植物CCR的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 7 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of CCR from different plants

3 討論

(1)高質(zhì)量RNA的提取是開展分子生物學(xué)研究的最基本也是最重要的基礎(chǔ)步驟,特別是要分離克隆出完整的全長(zhǎng)cDNA,獲得完整的、未被降解的大量的RNA顯得尤為關(guān)鍵,因?yàn)镽NA的質(zhì)量決定著可被反轉(zhuǎn)錄為cDNA最大的序列信息。

在RNA提取中防止RNA酶對(duì)RNA的降解極為重要。在提取RNA過(guò)程中要嚴(yán)格防止RNA酶的污染,所有塑料制品要用DEPC水處理并滅菌,玻璃器皿干熱滅菌,所用試劑均要做無(wú)RNA酶處理。在剝?nèi)≈参锝M織時(shí)速度要快,盡量減少直接暴露于空氣中的時(shí)間,立即投入液氮中研磨。

(2)通過(guò)GenBank聯(lián)機(jī)檢索,根據(jù)已報(bào)道的CCR基因序列的高度保守區(qū)用Primer Primier 5設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,再用Oligo6驗(yàn)證?;虻母叨缺J貐^(qū)在不同物種中個(gè)別堿基的差異給簡(jiǎn)并引物的有效使用帶來(lái)了困難。雖然在引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮到諸多因此,但是究竟能否有效擴(kuò)增目的片段畢竟還是需要將每一對(duì)引物,通過(guò)反復(fù)優(yōu)化PCR條件的方法來(lái)驗(yàn)證。因此,得到一對(duì)有效的引物可以大大地提高工作效率。

(3)木質(zhì)素由不同的木質(zhì)素單體聚合而成。近年來(lái),人們利用分子生物學(xué)的手段對(duì)參與木質(zhì)素合成的一些關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了研究,對(duì)木質(zhì)素合成過(guò)程的關(guān)鍵酶進(jìn)行了克隆,并進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因的實(shí)驗(yàn)對(duì)這些關(guān)鍵酶對(duì)于改變木質(zhì)素的含量或木質(zhì)素的組成及化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了研究。參與木質(zhì)素合成的酶有許多,CCR作為木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶,對(duì)于木質(zhì)素生物合成具有重要作用。本文從杉木木質(zhì)部中克隆了木質(zhì)素合成酶CCR基因,通過(guò)對(duì)該基因的生物信息學(xué)分析證明了我們克隆到的基因就是CCR基因,為后續(xù)的CCR結(jié)構(gòu)功能鑒定和研究打下了基礎(chǔ)。我們期望通過(guò)克隆、鑒定杉木木質(zhì)素合成基因,能對(duì)通過(guò)基因工程改變杉木木質(zhì)素含量以及改良杉木材性方面起到一定的作用。

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