楊冰 王海彬 梁篤 王軍艦 方芳 高明慧 劉文明 周曦

雌激素相關(guān)受體被認(rèn)為主要通過與過氧化物酶體增殖物受體α共激活因子PGC-1α、PGC-1β相互作用，共同調(diào)控氧化磷酸化通路上的基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控能量代謝的平衡。除了參與調(diào)控能量代謝外，ERRα還被認(rèn)為是乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、以及前列腺癌等多種癌癥的診斷靶標(biāo)[1-5]。研究顯示抑制ERRα活性或者降低其表達(dá)可以有效地抑制多種癌細(xì)胞的增殖[6-8]。但在癌細(xì)胞中，ERRα對糖代謝的調(diào)控尚不明確。本研究將有利于我們深入了解ERRα對癌細(xì)胞能量代謝的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌A 549細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(A TCC)。培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素的RPM I1640培養(yǎng)液、RPM I1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2潮濕二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所用細(xì)胞都處于對數(shù)生長期，根據(jù)ATCC網(wǎng)站提供的方法步驟進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試劑

DM EM培養(yǎng)基購于Gib co公司，胎牛血清購于H y clone公司，TRizo l和SuperScrip tTM Ⅲ RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Inv itrogen公司，5-3H-g lucose和2-deox y-D-[2,6-3H]glucose購自北京原子高科，SYBR RT-PCR定量PCR試劑盒購自Takara公司。其余常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 糖酵解

A549細(xì)胞以80000每孔傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，之后加入不同濃度的XCT-790繼續(xù)培養(yǎng)24h，糖酵解根據(jù)以前的報(bào)道通過測定5-3H-glucose向3H2O的轉(zhuǎn)變進(jìn)行[9]。簡述如下：K reb緩沖液(100μl)孵浴A549細(xì)胞0.5h，每孔加入10μL5-3H-glucose繼續(xù)在37℃5%CO2溫濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h。每孔加入50μL0.2mol/LHCl終止反應(yīng), 將100μL反應(yīng)液加入到開蓋的0.5m l離心管中，將離心管樹立與一個(gè)含有0.5m lH2O的4m l閃爍管中密封，室溫放置2d。閃爍液加入到原來的diffused counts和第2個(gè)undiffused counts管中。彌漫(diffused)和非彌漫(undiffused)的3H進(jìn)行閃爍檢測，糖酵解效率以細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行校正。

1.4 糖吸收

A 549細(xì)胞以80000每孔傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，之后加入不同濃度的XCT-790繼續(xù)培養(yǎng)24h。PBS洗滌2次，F(xiàn)CB溶液(K reb’s R inger with 2mm ol/L py ruvate and 2% BSA)37℃孵浴35m in。加入2-deoxy-D-[2,6-3H]g lucose(8.3μCi/m L)繼續(xù)培養(yǎng)10m in，冰冷的PBS洗滌2次，同位素閃爍活性通過加入閃爍液進(jìn)行檢測。糖吸收以細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行校正。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

將細(xì)胞以2×105每孔傳代于6孔板中，培養(yǎng)過夜。加入XCT-790繼續(xù)作用24h，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，SuperScriptTMⅢ RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生cDNA，保存于-20度冰箱。設(shè)計(jì)基因特異引物，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)，以18S rRNA作為內(nèi)源對照。

2 結(jié)果

2.1 XCT-790對細(xì)胞糖酵解的影響

先前的研究證實(shí)，ERR特異性抑制劑XCT-790可以顯著的增加肺癌A 549細(xì)胞的三羧酸循環(huán)，三羧酸循環(huán)的提高將增加葡萄糖的利用[7]。在本研究中，首先采用同位素示蹤技術(shù)檢測XCT-790對細(xì)胞糖酵解效率的影響。結(jié)果顯示XCT-790可以顯著地增加肺癌A 549細(xì)胞糖酵解效率(圖1)。

2.2 XCT-790對細(xì)胞糖吸收的影響

糖酵解效率的提高意味著細(xì)胞對葡萄糖利用的增加，因此細(xì)胞需要吸收更多的葡萄糖以滿足細(xì)胞的糖代謝。采用同位素示蹤技術(shù)研究XCT-790對肺癌A 549細(xì)胞糖吸收的影響，發(fā)現(xiàn)XCT-790可以顯著地增加肺癌A 549細(xì)胞糖吸收(圖2)。

2.3 XCT-790對細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖1 XCT-790顯著地增加肺癌A 549細(xì)胞糖酵解效率 *P＜0.01，**P＜0.01。

圖2 XCT-790顯著地增加肺癌A 549細(xì)胞糖吸收 *P＜0.01，**P＜0.01。

圖3 XCT-790顯著地增加Tigar基因表達(dá)**P＜0.01。

最新的研究顯示，抑癌蛋白p53可以通過調(diào)控其下游基因Tigar基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞的糖代謝[10]。先前的研究已經(jīng)證實(shí)XCT-790可以顯著的增加p53蛋白的表達(dá)[11]。在本研究中，采用定量PCR進(jìn)一步證實(shí)XCT-790可以顯著地增加Tigar基因表達(dá)(圖3)。

3 討論

ERRα與共激活因子PGC-1s能夠通過協(xié)同調(diào)控下游靶基因表達(dá)影響線粒體的生成，并通過MCAD等直接刺激細(xì)胞的脂肪酸氧化促進(jìn)細(xì)胞的脂肪酸利用，因而研究者們起初認(rèn)為ERRα的激活劑能夠起到促進(jìn)脂肪酸利用、增加肌肉細(xì)胞胰島素敏感性，以達(dá)到預(yù)防和治療糖尿病的目的。與之相矛盾的是，ERRα基因敲除小鼠能夠抵抗高脂飼料引起的肥胖，而且ERRα可以促進(jìn)三羧酸循環(huán)抑制蛋白丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)的表達(dá)，從而抑制糖酵解和糖吸收，因而ERRα的抑制劑也可能有利于代謝性疾病的治療。我們先前的研究也證實(shí)抑制ERRα活性可以有效地增加細(xì)胞三羧酸循環(huán)，在本研究中進(jìn)一步證實(shí)ERRα的特異性抑制劑XCT-790可以顯著提高癌細(xì)胞的糖酵解和糖吸收能力。除了在能量代謝中的重要作用，ERRα現(xiàn)在又被發(fā)現(xiàn)是多種癌癥的治療靶標(biāo)，但其分子機(jī)理作用尚不清楚。癌癥與能量代謝的關(guān)系以及ERRα在兩者之間的作用尚需要進(jìn)一步的研究。值得注意的是，抑癌蛋白p53可以通過增加其靶基因Tigar的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞的糖代謝，而我們先前的研究證實(shí)XCT-790可以顯著地增加p53蛋白表達(dá)。在本研究中XCT-790可以顯著地增加Tigar基因的表達(dá)。因此Tigar可能在ERRa調(diào)控能量代謝和癌細(xì)胞增殖中起到一定的作用。因此我們的研究提供了關(guān)于一個(gè)能量代謝和癌癥發(fā)生之間的聯(lián)系，通過能量代謝的調(diào)控可能是一個(gè)有效的治療癌癥的途徑。

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