陸洪軍 王淑秋 劉振平 任翊華

(佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科,黑龍江 佳木斯 154002)

在腫瘤的生物學(xué)行為中,浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是最重要的特征,也是一些實(shí)質(zhì)性腫瘤難以治愈的原因。盡管外科手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療日益完善,但如何早期診斷,及時(shí)正確治療,抑制惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,提高患者的生存率已成為當(dāng)今腫瘤防治的重要課題。研究證實(shí),上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是包括結(jié)腸癌在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子Snail通過(guò)與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)的 E-盒(E-box)結(jié)合,下調(diào) E-cadherin的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo) EMT的發(fā)生,促使腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移〔1〕。本文旨在探討轉(zhuǎn)錄因子 Snail在結(jié)腸癌中的表達(dá),以判定該轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2007年1月至 2008年 8月,在本院行根治性手術(shù)的大腸癌患者 68例,男 42例,女 26例;年齡 32～75歲(中位年齡 57.3歲);術(shù)中留取標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未接受化療及放療。①腫瘤部位:左半結(jié)腸 38例、右半結(jié)腸 30例;②腫瘤大小:≤5cm者 48例、＞5cm者20例。③組織學(xué)分型:乳頭狀腺癌 4例,管狀腺癌 48例,黏液腺癌 11例,印戒細(xì)胞癌 5例;④分化程度:高分化腺癌 24例,中分化腺癌 30例,低分化腺癌 14例;⑤浸潤(rùn)深度:未及漿膜層 25例,浸及漿膜層 43例;⑥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有轉(zhuǎn)移 18例,無(wú)轉(zhuǎn)移 50例;⑦Dukes分期:A期 32例,B期 20例,C期 11例,D期 5例。另取 20例結(jié)腸癌正常腸段的腸黏膜(經(jīng)病理檢查無(wú)異常)作對(duì)照。

所用試劑為兔抗人Snail多克隆抗體(購(gòu)自 Santa Cruz公司);逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(購(gòu)自 Promega公司);Trizol試劑(購(gòu)自美國(guó)寶生公司)。

1.2 方法

1.2.1 Snail mRNA檢測(cè) 按 Trizol試劑盒說(shuō)明提取總 RNA。用紫外分光光度儀測(cè)定 A 260/A 280,比值在 1.9～2.0之間,計(jì)算 RNA含量。引物設(shè)計(jì):(1)上游引物:5′-AATCGGAAGCCTAACTACAG-3′;下 游引物 :5′-GGAACAGGCTGAAGTAGAG-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度 320 bp)。 (2)GAPDH:上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′;下 游 引 物:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(擴(kuò)增長(zhǎng)度 452 bp,為內(nèi)參照)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒操作。RT-PCR產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。

1.2.2 Snail蛋白的檢測(cè) Western印跡法?？偟鞍滋崛?4℃收集細(xì)胞,每孔加入 100μl細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L pH 8.0 EDTA、1%NP40、0.05%PMSF、2μg/ml Aprotinin、0.5 μg/ml Leupeptin),超聲破碎,4℃12 000 r/min離心 5 min,收集上清液。細(xì)胞核蛋白提取:參照文獻(xiàn)方法〔2,3〕,略改動(dòng)。蛋白質(zhì)樣品與等體積 2×上樣 buffer混勻,煮沸 5min,紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。按蛋白含量測(cè)定結(jié)果每孔上樣 50μg,12.5%SDS-PAGE分離樣品。低溫100V 3 h將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上,用封閉液(5%脫脂奶粉、3%BSA、0.02%Tween-20溶于 PBS)室溫封閉 2 h,將膜與溶于封閉液中的一抗(兔抗人 Snail多克隆抗體 1∶500)室溫孵育2 h,PBS洗 5 min×3次,TBS洗5 min×4次,將膜與溶于二抗稀釋液 (5%脫脂奶粉、0.02%Tween-20、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5)中的二抗室溫孵育 1 h,TBS洗5 min×4次,將膜裝入可熱接封的塑料袋中,加入 ECL試劑,暗室曝光、顯影、定影,對(duì) X光底片拍照保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示,應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組Snail mRNA相對(duì)水平經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后采用 Student-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌組織Snail mRNA表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Snail mRNA在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位及大小無(wú)關(guān)(P＞0.05),而與腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 Dukes分期均有關(guān)。Snail mRNA在黏液癌(印戒細(xì)胞癌、黏液腺癌)、低分化、浸及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及處于 Dukes C+D期的結(jié)腸癌組織中表達(dá)均明顯增高(P＜0.05,P＜0.001)。Snail與結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。見(jiàn)表 1。

表1 結(jié)腸癌組織Snail mRNA表達(dá)指數(shù)與臨床病理因素間的關(guān)系(x±s)

2.2 結(jié)腸癌和癌旁組織 Snail mRNA及其蛋白的表達(dá) 結(jié)腸癌組織與癌旁正常腸黏膜組織中均有 Snail mRNA表達(dá),但與正常結(jié)腸上皮相比較,結(jié)腸癌 Snail mRNA的表達(dá)升高(P＜0.01)。見(jiàn)表 2和圖 1。結(jié)腸癌 Snail P30條帶較正常對(duì)照組加寬加深,應(yīng)用Chen Image 5500v2.03軟件計(jì)算蛋白平均灰度值,結(jié)果顯示 Snail蛋白表達(dá)與正常結(jié)腸上皮相比較,有顯著差異(P＜0.001)。見(jiàn)表 2和圖 2。

圖1 Snail m RNA的表達(dá)

表2 結(jié)腸癌和癌旁正常腸黏膜組織中Snail m RNA及其蛋白的表達(dá)(x±s)

圖2 Snail P30的表達(dá)

3 討 論

EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,是許多腫瘤細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制〔4〕。EMT在個(gè)體胚胎發(fā)育、組織形成、傷口愈合和慢性炎癥中,均發(fā)揮著重要作用〔5〕。研究證實(shí),Snail參與了包括乳腺癌、胃癌和鱗狀上皮細(xì)胞癌在內(nèi)的某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移〔6～8〕。 Snail可使細(xì)胞 E-鈣黏素及 α、β 、γ-連環(huán)素等上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)降低或消失,可表達(dá)成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1、N-連環(huán)素等多種間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白,且可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在一定條件下逆轉(zhuǎn) EMT表型時(shí),就可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力并延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的生存期。

Snail通過(guò)以下機(jī)制引起腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移:①作用于啟動(dòng)子上的 E-boxes連接基序,直接抑制 E-cadherin、claudins、occludins等上皮黏附位點(diǎn)成分的轉(zhuǎn)錄,使細(xì)胞間黏附紊亂;②抑制ABLIM-l、EPLIN等細(xì)胞骨架成分表達(dá),使細(xì)胞骨架重組;③促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá),降解基質(zhì)以促進(jìn)細(xì)胞侵襲。研究證實(shí),Snail引起的EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但不是惟一的,免疫抑制也起著一定作用〔9〕。

本研究表明:(1)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織Snail mRNA及其蛋白表達(dá)間存在差異:結(jié)腸癌組織 Snail mRNA及其蛋白表達(dá)增加,提示Snail的高表達(dá)是結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要事件。(2)Snail mRNA及其蛋白的表達(dá)與組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期均有關(guān):在黏液癌、低分化、侵及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和處于 Dukes C+D期的結(jié)腸癌中 Snail mRNA及其蛋白表達(dá)明顯升高,同樣提示 Snail的表達(dá)增加可以評(píng)價(jià)結(jié)腸癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。

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