王淑強(qiáng) 李秀娟 李 鵬 武 欣 王琳冬

(河北北方學(xué)院病理教研室,河北 張家口 075000)

近年來(lái)研究表明,環(huán)氧合酶(COX)-2在多種腫瘤中均呈高表達(dá),在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、分化、轉(zhuǎn)移中起重要作用。在細(xì)胞癌變過(guò)程中,Wnt通路異常變化可能具有重要作用,COX-2是 Wnt通路的靶基因,可通過(guò)增強(qiáng) MMPs的表達(dá),促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移〔1〕。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大腸癌及大腸遠(yuǎn)端正常黏膜中COX-2的表達(dá)情況,探討COX-2在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用,為預(yù)測(cè)大腸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本 58例,男 28例,女 30例,年齡 30～78歲(平均 58.3歲)。病變部位:結(jié)腸癌 22例,直腸癌 36例;分化程度:高分化腺癌 26例,中分化腺癌 20例,低分化腺癌 6例,黏液腺癌 6例;轉(zhuǎn)移情況:有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 27例。同時(shí)選取大腸癌遠(yuǎn)端正常黏膜組織 10例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人 COX-2單克隆抗體(Santa Crus Biotechonlogy,INC),羊抗兔IgG-FITC,DAB顯示劑,均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 單細(xì)胞懸液的制備:石蠟包埋組織 HE染色,切成 40μm厚的組織片 5片,放入 10ml的試管中,加入二甲苯 8 ml,在室溫下脫蠟 2d,其間更換 2次二甲苯,石蠟脫凈后,棄去二甲苯;依次加入 100%、95%、70%、50%梯度乙醇5 ml,每步 10 min,加入蒸餾水 5 ml,10 min后棄之。加入2 ml 0.5%胰蛋白酶 (pH1.5)消化液,置 37℃恒溫水浴中消化30 min,在消化期間,每隔 10 min用振蕩器振蕩 1次,消化30 min后,立即加生理鹽水終止消化,經(jīng) 300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾,未消化好的組織可做第二次消化。收集細(xì)胞懸液,以1 500 r/min離心沉淀 5 min,再用生理鹽水漂洗 2次,以800r/min離心沉淀 5 min,去碎片。細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記:取單細(xì)胞懸液 1×106/ml,加入兔抗人COX-2單克隆抗體工作液0.1ml室溫孵育 30 min,加入 PBS 10 ml洗滌 1次,棄上清,加入羊抗兔 FITC-IgG二抗工作液 10 ml,避光室溫孵育30 min,加入 PBS 10ml,800 r/min離心沉淀 5min,棄上清除去未結(jié)合的熒光二抗,上機(jī)檢測(cè)并加入PBS 0.1 ml經(jīng) 500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。蛋白免疫熒光標(biāo)記物測(cè)定設(shè)一抗或二抗的本底對(duì)照和陰性對(duì)照。檢測(cè)條件及參數(shù)采用美國(guó) Beckman Coulter公司生產(chǎn)的 Epics-XLII型流式細(xì)胞儀,應(yīng)用 Expo32ADC軟件分析數(shù)據(jù)。測(cè)定前以Flow check標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)整儀器的 CV值在 2%以?xún)?nèi)。

1.2.3 結(jié)果判定 根據(jù)流式細(xì)胞儀分析軟件測(cè)定出的平均熒光強(qiáng)度(Mode值)計(jì)算熒光指數(shù)(FI),并以 FI表示 COX-2基因蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱。FI=(樣品基因蛋白的表達(dá)熒光強(qiáng)度 -正常樣品的熒光強(qiáng)度)/正常樣品的熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用 x±s表示,采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2基因在正常黏膜和不同分化組中的表達(dá) COX-2表達(dá)平均 FI值正常黏膜組為 1.00±0.28,高、中、低分化及黏液腺癌組分別為 2.47±1.41、2.70±1.08、3.16±1.34和2.01±1.43,高、中、低分化及黏液腺癌組 COX-2表達(dá)均明顯高于正常黏膜組(P＜0.01)。

2.2 COX-2基因在大腸的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。大腸癌COX-2基因表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05),與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的發(fā)生部位等無(wú)關(guān)。

表1 COX-2基因在大腸癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(x±s)

3 討 論

人的 COX-2基因定位于第一號(hào)染色體 1q25.2-25.3,長(zhǎng)約8.3kb,其 mRNA約 4.5 kb,由 10個(gè)外顯子和 9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成;COX-2基因的 3URT區(qū)域包含 1.5 kb的 22個(gè) AUUUA基因序列,與 mRNA不穩(wěn)定有關(guān)〔2〕。 COX-2基因編碼 604個(gè)氨基酸,含 17個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。COX是一種與生物膜相結(jié)合的花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過(guò)程中發(fā)揮作用的限速酶。COX-2基因?yàn)檎T導(dǎo)型蛋白,被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”,靜息時(shí)不表達(dá),當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激時(shí)則迅速合成,表達(dá)增加癌癥的發(fā)生是原癌基因激活和抑癌基因失活為基礎(chǔ)的多步驟、多階段過(guò)程,通常其表達(dá)產(chǎn)物作用于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及代謝過(guò)程,最終導(dǎo)致癌變。COX-2在多種腫瘤如食管癌、腎癌、胰腺癌等組織中均有表達(dá),研究表明,它在腫瘤的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。COX-2促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和腫瘤的惡性表型轉(zhuǎn)換的可能機(jī)制〔3〕:(1)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制:可通過(guò)減弱和抑制 NO信號(hào)途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。(2)促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生:血管內(nèi)皮細(xì)胞通常不會(huì)增生,除非受到某些刺激,腫瘤血管的形成是針對(duì)不同因子的刺激而發(fā)生。VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)增高血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞變形、遷徙等促進(jìn)腫瘤血管生成〔4〕。研究證實(shí),COX-2表達(dá)與 VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)〔5～7〕。(3)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移:COX-2高表達(dá)還常導(dǎo)致一種浸潤(rùn)抑制因子 E-cadherin在細(xì)胞中缺失,E-cadherin缺失有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。(4)調(diào)節(jié)免疫抑制功能。(5)導(dǎo)致原癌基因的激活和抑癌基因的缺失或突變:COX-2在正常大腸黏膜中檢測(cè)不到,而在 80%的大腸癌中呈過(guò)表達(dá)。Lambropoulou等〔8〕發(fā)現(xiàn),在子宮內(nèi)膜癌中 COX-2的表達(dá)與肌層浸潤(rùn)深度密切相關(guān),提示 COX-2表達(dá)與腫瘤的局部擴(kuò)散有關(guān)。姚楠〔9〕研究顯示,COX-2在大腸腺癌的發(fā)展過(guò)程中其表達(dá)呈增高趨勢(shì),提示COX-2在大腸腺癌的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。本研究顯示,正常黏膜組 COX-2表達(dá)平均 FI值明顯低于高、中、低分化組,提示 COX-2可能在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)還顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 COX-2表達(dá)平均FI值顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,提示 COX-2的高表達(dá)預(yù)示著大腸癌患者有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率,而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響大腸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo),但COX-2的表達(dá)與患者的年齡、性別、發(fā)生部位、分化程度等無(wú)關(guān)。

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