萬桂蓮,倪道鳳,關(guān) 靜

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科,北京100730)

上呼吸道病毒性感染是引起嗅覺障礙的常見疾病,發(fā)病率約為20-30%[1]。引起呼吸道病毒性感染的常見病原有流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒、腸道病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和麻疹病毒,其中流感病毒對嗅覺的影響已為許多學(xué)者廣泛研究[2,3]。臨床上常應(yīng)用糖皮質(zhì)激素來治療上呼吸道病毒性感染引起的嗅覺障礙。糖皮質(zhì)激素治療嗅覺障礙的報道較多,而對布地奈德的觀察少見報道。本研究以嗅覺標(biāo)記蛋白(olfactory marker protein,OMP)為研究指標(biāo),選用甲型流感病毒(HINI),模擬上呼吸道病毒感染動物模型,觀察布地奈德對流感病毒感染后小鼠嗅上皮OMP的作用,以期為臨床應(yīng)用激素治療嗅覺障礙提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物選用無致病原近交系BALB/c小鼠,雄性,六周齡,體重20±1 g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供,動物在同一條件下由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所飼養(yǎng)。

1.1.2 流感病毒 流感病毒鼠適應(yīng)株A/PR8/34(H1N1)病毒液,由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供。分裝后凍存于-80℃冰箱備用。

1.1.3 主要的試劑 山羊抗鼠嗅標(biāo)記蛋白抗體,購自Wako有限公司;辣根酶標(biāo)記兔抗山羊抗體,非生物素二步法免疫組化檢測試劑(Two-Step IHC Detection Reagent,PV-6003),購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;專用硝酸纖維(nitrocellulose,NC)膜,購自Amersham Biosciences公司;ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒,購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 將50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組(每組10只小鼠):非感染對照組(正常對照組)、流感病毒感染對照1組(病毒對照1組),流感病毒感染對照2組(病毒對照2組),布地奈德1組,布地奈德2組,分別與病毒對照1組和病毒對照2組對照。

1.2.2 病毒接種 本實驗根據(jù)Reed-Muench法測定流感病毒鼠適應(yīng)株A/PR8/34(H1N1)病毒對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為10-3.5,根據(jù)LD50結(jié)果將流感病毒液按10-4稀釋,小鼠乙醚吸入麻醉,用可調(diào)微量移液器取50 μ l病毒液,緩慢適量滴進(jìn)小鼠的前鼻孔,每側(cè)25 μ l,使病毒液隨呼吸氣流緩慢進(jìn)入鼻腔,待麻醉恢復(fù)后,將小鼠按組分籠隔離飼養(yǎng)。

1.2.3 給藥 經(jīng)鼻吸入布地奈德組按3 mg/kg給藥[4,5],布地奈德1組小鼠在病毒感染1天后開始給藥,布地奈德2組小鼠在病毒感染3天后開始給藥,病毒1組和病毒2組分別在相同時間點均經(jīng)鼻吸入等量的生理鹽水。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 染色方法采用SP法。分別在第7天和第10天從每組小鼠取3只,麻醉灌注后取鼻腔標(biāo)本常規(guī)固定和切片。采用PH8.0Tris-EDTA修復(fù)液,微波熱修復(fù),92-98℃,10 min,于室溫中冷卻,放入3%H2O2溶液室溫10 min,滴加1抗OMP蛋白抗體(1∶4 000),37℃恒溫箱孵育 1.5 h。滴加非生物素2抗(1∶5 000),37℃恒溫箱孵育30分鐘,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒顯色,染色時間為25秒,蘇木素復(fù)染,水洗,鹽酸酒精分化,常規(guī)脫水、透明、封片,光學(xué)顯微鏡觀察雙側(cè)鼻腔嗅區(qū)粘膜。陰性對照實驗采用正常山羊血清代替一抗,其余步驟同上。在顯微鏡下計數(shù)每只小鼠鼻腔切片嗅區(qū)粘膜內(nèi)5個高倍視野(x400)下OMP陽性細(xì)胞數(shù),取其平均值為該例的測量值。

1.2.5 嗅粘膜組織全蛋白提取 在第7天和第10天分別從每組取出7只小鼠,頸椎脫臼法處死小鼠,矢狀位正中裂開鼻腔,解剖顯微鏡下取鼻中隔嗅區(qū)黏膜,經(jīng)不銹鋼篩網(wǎng)研磨過濾,留取細(xì)胞混懸液,放入離心機(jī)離心2次(4 000 r/min,5 min-1),棄上清液,加入適量的細(xì)胞裂解液(Tris HCl 2 ml,NaCL 6 ml,EDTA 0.2 ml,EGTA 0.2 ml,Tritonx-100 1 ml,焦磷酸鈉 0.066 5 g,β-甘油磷酸鈉 0.1 ml,原礬酸鈉 10 ml,蒸餾水 85 ml),冰上裂解10分鐘,超聲細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞8次(200 W,5 s-1,間隔5 s),再放于低溫超速離心機(jī)中離心(4℃,12 000 r/min,25 min),取上清液,Bardford法檢測上清液蛋白濃度。

1.2.6 western blot 根據(jù)OMP蛋白分子質(zhì)量大小(20 KD),制作15%的分離膠和5%的濃縮膠,取標(biāo)本細(xì)胞裂解蛋白20 μ g,進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V,凝膠-NC膜轉(zhuǎn)移裝置浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液,恒壓80 V轉(zhuǎn)移2 h,轉(zhuǎn)到NC膜上,用5%的脫脂牛奶封閉2 h,然后加入1抗山羊抗鼠嗅標(biāo)記蛋白抗體(1∶2 000)封閉,放于搖床上室溫2 h,洗膜后加入2抗辣根酶標(biāo)記兔抗山羊抗體(1∶4 000)孵育1 h,洗膜后加ECL顯像劑,將NC膜放入壓片暗盒,膠片曝光顯影。所獲結(jié)果經(jīng)灰度定量掃描,以β-actin條帶為內(nèi)參照,校正對應(yīng)的OMP條帶,測定各顯色條帶的吸光度值,半定量表示其表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有資料采用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理,所得到的數(shù)值均以±s表示,各組數(shù)據(jù)的比較應(yīng)用配對t檢驗和獨立樣本t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 OMP在嗅粘膜的表達(dá)定位和陽性率比較 光鏡下OMP陽性主要定位于小鼠嗅粘膜的上皮層,呈棕褐色或淺棕色染色。正常對照組小鼠嗅上皮OMP染色陽性細(xì)胞呈棕褐色,大量分布于嗅上皮層(圖1A)。病毒對照組小鼠嗅上皮OMP染色陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖1B,D),而與病毒對照組相比,布地奈德組小鼠嗅上皮OMP染色陽性細(xì)胞明顯增加(圖1C,E)。經(jīng)圖像分析結(jié)果顯示,布地奈德1組和布地奈德2組嗅上皮OMP陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于病毒對照1組和病毒對照2組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);病毒對照1組和病毒對照2組OMP陽性細(xì)胞數(shù)分別低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);布地奈德1組、布地奈德2組與正常對照組三組間分別比較,均沒有顯著性差異;病毒對照1組和病毒對照2組比較沒有顯著性差異(表1)。在陰性對照組的嗅上皮沒有觀察到OMP染色陽性細(xì)胞(圖1F)。

圖1 各組小鼠嗅上皮OMP表達(dá)的變化(×400)

表1 各組小鼠嗅上皮OMP陽性細(xì)胞的變化(±s,n=3)

表1 各組小鼠嗅上皮OMP陽性細(xì)胞的變化(±s,n=3)

P＜0.01,與病毒對照組比較

組別 OMP陽性細(xì)胞數(shù)正常對照組 72.44±1.31*病毒對照1組 56.12±2.10布地奈德1組 71.34±1.89*病毒對照2組 60.51±1.62布地奈德2組 70.98±1.43*

2.2 對流感病毒感染的嗅上皮布地奈德干預(yù)后OMP蛋白表達(dá)水平的變化 布地奈德1組OMP蛋白表達(dá)水平較病毒對照1組顯著增高(P＜0.01),與正常對照組和布地奈德2組沒有顯著性差異。布地奈德2組OMP蛋白表達(dá)水平比病毒對照2組顯著增高(P＜0.01),與正常對照組和布地奈德1組沒有顯著性差異。病毒對照1組和病毒對照2組OMP蛋白表達(dá)水平均比正常對照組明顯降低(P＜0.01),而病毒對照1組和病毒對照2組兩組間沒有顯著性差異(圖2)。

圖2 布地奈德對嗅上皮OMP蛋白表達(dá)的影響(±s,n=3)

3 討論

0MP是由成熟的嗅感覺神經(jīng)元表達(dá)的一種蛋白質(zhì),在嗅上皮主要存在于嗅感覺神經(jīng)元的胞體內(nèi)。本實驗研究選擇的檢測指標(biāo)OMP是由Margolis在1972年首先發(fā)現(xiàn)的[6]。Nathan等研究發(fā)現(xiàn)大鼠OMP的結(jié)構(gòu)是一種單球形結(jié)構(gòu)域蛋白,有2個長的α-螺旋和8條β折疊片斷。8條β鏈互相折疊形成β-殼狀結(jié)構(gòu)組成OMP的中心。在殼狀結(jié)構(gòu)的另一面形成兩個互相垂直的長螺旋結(jié)構(gòu),此外還有3個大的延伸的環(huán)狀區(qū)域,包括環(huán)1、環(huán)2和環(huán)3。環(huán)3與EphB2受體具有同源性,這可能對于調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用具有重要意義[7]。目前已知OMP在嗅覺系統(tǒng)發(fā)育、嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、嗅神經(jīng)生理和神經(jīng)發(fā)生等方面有重要作用[8]。

流感病毒感染和病毒復(fù)制過程可刺激機(jī)體產(chǎn)生和釋放促炎細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-6等[9],引起以CD4+T淋巴細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)[10],引起鼻粘膜充血水腫,妨礙氣味分子與嗅粘膜表面接觸,影響嗅覺。有研究表明流感病毒感染可直接損傷嗅感覺神經(jīng)元,誘導(dǎo)其凋亡引起嗅覺障礙[3,11]。臨床上應(yīng)用布地奈德治療嗅覺障礙主要是利用布地奈德的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,減弱鼻粘膜的充血和腫脹,改善鼻道通氣狀態(tài),以期改善嗅覺。布地奈德改善嗅覺障礙除了上述機(jī)制外,是否對嗅感覺神經(jīng)元有直接作用也引起一些學(xué)者的關(guān)注。為了探討布地奈德對病理狀態(tài)下嗅感覺神經(jīng)元的作用,本實驗以O(shè)MP為研究指標(biāo),選用A/PR8/34甲型流感病毒感染小鼠,模擬上呼吸道病毒感染動物模型,觀察布地奈德對流感病毒感染后小鼠嗅上皮OMP表達(dá)的影響,以期為臨床應(yīng)用布地奈德治療嗅覺障礙提供一定的實驗依據(jù)。

本實驗采用免疫組化和western blot方法檢測嗅上皮OMP表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)布地奈德組小鼠嗅上皮OMP的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),提示布地奈德能促進(jìn)小鼠嗅上皮OSNs的OMP表達(dá)。布地奈德通過與胞漿內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體(glucocorti-coid receptor,GR)結(jié)合誘導(dǎo)受體構(gòu)象發(fā)生變化,使其與核內(nèi)靶基因的激素反應(yīng)元件結(jié)合,激活或抑制靶基因的表達(dá)。2008年P(guān)uiols等用活檢鼻息肉病理標(biāo)本應(yīng)用免疫組化和RT-PCR技術(shù)證實鼻用布地奈德能夠上調(diào)鼻粘膜中GRα mRNA表達(dá),GRβ表達(dá)沒有顯著性變化[12]。這個理論支持布地奈德參與了嗅上皮OMP蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。本研究中病毒對照組小鼠嗅上皮OMP的表達(dá)量明顯下降,提示流感病毒能損害OSNs而抑制OMP表達(dá),本實驗結(jié)果支持陳志宏等的觀點[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)布地奈德使流感病毒感染小鼠嗅感覺神經(jīng)元的OMP蛋白表達(dá)增加,由此我們推測布地奈德與嗅感覺神經(jīng)元胞漿內(nèi)的GR結(jié)合,糖皮質(zhì)激素-受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核,作用于糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件的特異性DNA序列,啟動OMP基因表達(dá),經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯合成蛋白質(zhì),影響嗅覺信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),為布地奈德改善嗅覺障礙提供一定的實驗依據(jù),但本實驗僅是模擬上呼吸道病毒感染動物模型,仍有一定的局限性,需要建立各種嗅覺障礙動物模型繼續(xù)觀察布地奈德的作用,以期為臨床嗅覺障礙的治療提供可靠的指導(dǎo)依據(jù)。

致謝:在本實驗過程中得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)國家重點實驗室許彩民教授指導(dǎo)和楊洋老師與實驗病理中心陳錫萍老師幫助,特此感謝。

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