胡國元，游慧珍，董蘭蘭，戴欣鵬，李偉偉，胡 婧，李友國

(1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省新型反應(yīng)器與綠色工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070)

0 引 言

茯苓(Poriacocos)屬食藥兩用的大宗藥材.茯苓的主要成分是β-茯苓聚糖，約占干重92％.其次為戊聚糖、果糖、葡萄糖、甲殼素、腺嘌呤、組氨酸、蛋白質(zhì)、粗纖維、膽堿、酶、卵磷脂、硬朊、麥角甾醇和灰分.另外，還含有三萜類化合物[1].從茯苓中提取制備的茯苓多糖或茯苓異多糖具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、補(bǔ)體激活、抗誘變、抗腫瘤 、增強(qiáng)免疫 等生物活性[2].茯苓加工利用或提取制備茯苓多糖的主要原料來源為茯苓菌核.但傳統(tǒng)的茯苓栽培法生產(chǎn)的茯苓菌核的生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量也不高,且松材消耗量大.用液體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)茯苓菌絲體，從茯苓菌絲體和發(fā)酵液中提取茯苓多糖等活性物質(zhì)，可較好地解決人工種植茯苓的替代問題，節(jié)省了大量的木材,對我國資源和生物多樣性的保護(hù)有著重要的意義.液體培養(yǎng)生產(chǎn)茯苓菌絲體可連續(xù)性地進(jìn)行規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，大大縮短了生產(chǎn)時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本[2-4].

文獻(xiàn)[3-5]報(bào)道碳源、氮源與初始pH值為影響茯苓菌絲體液體培養(yǎng)菌絲體產(chǎn)量和和發(fā)酵液中胞外多糖產(chǎn)量的主要因素.本實(shí)驗(yàn)對不同茯苓菌株的菌絲生長速度比較，篩選出生長速度較快的菌株，在此菌株的基礎(chǔ)上探討了接種量、接種方式、碳源、氮源、初始pH值等因素對茯苓的菌絲體產(chǎn)量和胞外多糖產(chǎn)量的影響，以期確定茯苓液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中最適碳源、氮源和初始pH值.為規(guī)?；后w培養(yǎng)茯苓菌絲體和生產(chǎn)茯苓多糖作前期研究工作.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 鄂苓1號(hào)：從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心購買.鄂苓2號(hào)：由湖北省中醫(yī)研究院王克勤研究員惠贈(zèng).鄂苓1號(hào)和鄂苓2號(hào)均為湖北省茯苓栽培菌株.

1.1.2 培養(yǎng)基 母種斜面培養(yǎng)基[5]：葡萄糖20 g，酵母菌膏2 g，蛋白胨2 g， KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，水1 L，pH值為自然狀態(tài).

平板培養(yǎng)基：同母種斜面培養(yǎng)基.

種子培養(yǎng)基[3,6]：葡萄糖20 g，酵母菌膏5 g，蛋白胨4 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 L.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：在不含碳源、氮源的種子培養(yǎng)基中，按L9(33)正交試驗(yàn)表(表1)加入相應(yīng)碳源和氮源，并調(diào)節(jié)pH值.

1.2 方法

1.2.1 接種和培養(yǎng) 由斜面菌種挑起1塊約1.0 cm2菌塊接入培養(yǎng)皿中央，26 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，菌絲均勻長滿培養(yǎng)皿，作為固體菌種備用[3,6].

在250 mL三角瓶裝入60 mL液體種子培養(yǎng)基，用打孔器把生長于平板外側(cè)的菌絲打孔接種到三角瓶，每瓶接種4塊直徑為8 mm的菌塊，培養(yǎng)溫度為26 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min的培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)7 d，作為液體菌種備用[3,6].

菌種設(shè)置為固體種(接種4塊直徑為8 mm的菌塊[6])、液體種(按6％菌種量接液體種[3])；搖瓶體積及裝液量設(shè)置為250 mL三角瓶裝液60 mL[3]；搖床轉(zhuǎn)速150 r/min[3]，溫度26 ℃[3]；接固體種培養(yǎng)15 d[6]，接液體種培養(yǎng)6 d[3].

1.2.2 正交試驗(yàn) 本試驗(yàn)選擇L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中的[3-4]，正交試驗(yàn)因素水平如表1.

表1 正交試驗(yàn)L9(33)因素與水平

1.2.3 分析和測定a.生長速度的測定.用打孔器打孔接種1塊直徑為8 mm活化的茯苓菌塊在直徑為95 mm的平板中央， 26 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h測定菌塊菌絲生長的直徑，菌絲長滿平板停止測量.根據(jù)直徑的大小比較不同菌株菌絲的生長速度.b.菌絲干重的測定. 收取的發(fā)酵液以砂芯漏斗真空抽濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌菌絲球，直到洗凈菌絲球中殘留的培養(yǎng)液，得到的菌絲球于60 ℃下烘干至恒重，以1 L發(fā)酵液中菌絲體干重(g/L)計(jì).c.多糖的測定.采用苯酚—硫酸法測定發(fā)酵液中總糖的含量，用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以校正系數(shù)0.9校正總糖含量的測定值，校正后的值為相應(yīng)發(fā)酵液中的多糖含量[7].d.pH值測定.采用pHS-3C酸度計(jì)測定pH值.

1.2.4 光學(xué)顯微鏡觀察 將液體培養(yǎng)形成的不同直徑大小的菌絲球分別取樣，制片，觀察，拍照[8].

2 結(jié)果與討論

2.1 不同茯苓菌株菌絲生長速度的測定

將活化的鄂苓1號(hào)、2號(hào)同時(shí)采用打孔器接種到平板上培養(yǎng)4 d，其菌絲生長速度測定結(jié)果見圖1.鄂苓1號(hào)、2號(hào)在平板上菌絲濃厚粗壯，長勢旺盛.從圖1可知，鄂苓2號(hào)比1號(hào)生長速率相對快些，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇鄂苓2號(hào)為試驗(yàn)菌株.

圖1 2個(gè)茯苓菌株菌絲生長速度測定

2.2 不同固體種接種量對茯苓菌絲體產(chǎn)量的影響

在250 mL三角瓶中裝入60 mL種子培養(yǎng)基，將活化的鄂苓2號(hào)菌種用打孔接種的方式接種，接種量設(shè)置為4、6、8和10塊.通過液體搖瓶培養(yǎng)，比較其生成的菌絲體重量來確定最佳接種量.結(jié)果表明(見表2)，接種量為4塊時(shí)，菌絲體產(chǎn)量最高.

表2 不同固體種接種量對茯苓菌絲體產(chǎn)量的影響*

2.3 不同接種方式對茯苓菌絲體產(chǎn)量的影響

在鄂苓2號(hào)的液體培養(yǎng)中，采用固體種、液體種接種，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，進(jìn)行對比試驗(yàn)的結(jié)果見表3.在茯苓菌絲培養(yǎng)過程中，接液體種比固體種產(chǎn)量高，菌絲發(fā)育點(diǎn)多、接種后菌絲蔓延迅速、菌齡整齊，培養(yǎng)的菌絲球大小較均勻.

表3 不同接種方式對茯苓菌絲體產(chǎn)量的影響*

2.4 茯苓液體培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗(yàn)

本試驗(yàn)選擇L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基[3-4]，正交試驗(yàn)因素水平見表1.分別做固體接種方式、液體接種方式的正交試驗(yàn)，分別以菌絲體干重、胞外多糖含量為考察指標(biāo)，分析試驗(yàn)結(jié)果，確定茯苓培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的最適碳源、氮源和初始pH值.

2.4.1 以菌絲體干重為指標(biāo)，固體接種方式的正交試驗(yàn) 采用固體接種茯苓菌絲塊4塊于搖瓶中培養(yǎng)15 d，以菌絲體干重為指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表4.

表4 固體接種的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表4可知，RA>RB>RC.說明3因素對固體接種培養(yǎng)菌絲體生物量的影響順序是碳源濃度>氮源濃度>pH值.菌絲體產(chǎn)生物量的最優(yōu)組合為：A2B2C2.由此可知，碳源濃度對茯苓菌絲體產(chǎn)量的影響最大，其次為氮源濃度，而培養(yǎng)基初始pH值影響最小.

2.4.2 以菌絲體干重為指標(biāo)，液體接種方式的正交試驗(yàn) 采用液體接種方式按6％的接種比例接液體種，搖床培養(yǎng)6 d，以菌絲體干重為指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表5.

表5 液體接種的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表5可知，RA>RB>RC.說明3因素對液體接種培養(yǎng)菌絲體生物量的影響順序是碳源濃度>氮源濃度>pH值.菌絲體產(chǎn)生物量的最優(yōu)組合為：A2B2C2.由此可知，碳源濃度對茯苓產(chǎn)量的影響最大，其次為氮源濃度，而初始pH值影響最小.

2.4.3 以胞外多糖為指標(biāo)，液體接種方式的正交試驗(yàn) 采用液體接種方式按6％的接種比例接液體種，搖床培養(yǎng)6 d以胞外多糖含量為指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表6.

表6 液體接種的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析(以胞外多糖為指標(biāo))

由表6可知，RA>RB>RC.說明3因素對液體接種培養(yǎng)的菌絲體胞外多糖含量的影響順序是碳源濃度>氮源濃度>pH值.菌絲體胞外多糖積累的最優(yōu)組合為：A3B3C1.由此可知，碳源濃度對茯苓胞外多糖產(chǎn)量的影響最大，其次為氮源濃度，而初始pH值影響最小.

2.5 菌絲球的形態(tài)觀察

本試驗(yàn)對固體接種方式液體培養(yǎng)后期的茯苓菌絲球進(jìn)行了顯微觀察，結(jié)果顯示發(fā)育較充分的圓形菌絲球有一個(gè)明顯中央核，外層菌毛區(qū)菌絲長度較長而且密度較大.而不規(guī)則的菌絲球的核并不像前者那么明顯.在整個(gè)發(fā)酵過程中，菌絲球直徑并不是都一樣的，分別對其進(jìn)行染色、制片觀察，可知直徑為1、2 mm的菌絲球著色均勻，說明菌絲的生活力強(qiáng).直徑為5 mm的菌絲球核出現(xiàn)著色不均勻的現(xiàn)象.而在發(fā)酵過程中由于轉(zhuǎn)速或粘度等的影響會(huì)產(chǎn)生非球形的大菌塊，其中間的菌絲不易著色[8].

3 討 論

通過比較接種量、接種方式、碳源、氮源、初始pH值等因素對茯苓的菌絲體產(chǎn)量和胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明：其作用大小是碳源>氮源>初始pH值.以菌絲干重為指標(biāo)，茯苓液體發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基中：最適碳源為葡萄糖(3％,質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，最適氮源為酵母浸膏(0.51％)和蛋白胨(0.4％)，最適初始pH值為5.5.以多糖為指標(biāo)，茯苓液體發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基中：最適碳源為葡萄糖(3.5％)，最適氮源為酵母浸膏(0.637％)和蛋白胨(0.5％)，最適初始pH值為5.0.茯苓菌絲球的形態(tài)觀察結(jié)果顯示菌絲球直徑大小、菌絲球中央核的大小及其染色均勻程度等都會(huì)影響到菌絲的生長速度，從而影響生物量[8].

在茯苓液體發(fā)酵過程中，采取液體接種具有生產(chǎn)周期短、菌絲發(fā)育點(diǎn)多、接種后菌絲蔓延迅速、菌齡整齊等特點(diǎn)，所以可以采用液體接種方式對茯苓進(jìn)行液體培養(yǎng)或用于制備用于茯苓栽培的液體菌種.茯苓發(fā)酵終點(diǎn)的判斷還需深入研究，目前多數(shù)真菌發(fā)酵主要依據(jù)菌絲體的產(chǎn)量、培養(yǎng)液中的pH值、還原糖、含氮量、培養(yǎng)液的顏色變化以及菌絲球的形態(tài)變化等來判斷[1,9].茯苓液體發(fā)酵過程中的C、N消耗、pH值需進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測，并結(jié)合菌絲球的形態(tài)變化等，確定發(fā)酵終點(diǎn).另外，在液體培養(yǎng)過程中，由于營養(yǎng)成分的消耗會(huì)使菌絲球的生長受到影響，也可以采用補(bǔ)料的方式[10]，提供其足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，延長發(fā)酵時(shí)間，來提高茯苓菌絲體及其胞外多糖的產(chǎn)量.

當(dāng)然，繼續(xù)選育適于液體培養(yǎng)的高產(chǎn)茯苓菌株也是今后應(yīng)進(jìn)一步研究的課題[11].李慧等[4]報(bào)道無機(jī)碳源與有機(jī)碳源和無機(jī)氮源與有機(jī)氮源配合使用，有利于茯苓菌絲體大量生長繁殖，并可誘導(dǎo)促進(jìn)茯苓多糖的產(chǎn)生和積累,為此，茯苓液體培養(yǎng)的優(yōu)化工作還需繼續(xù)探索下去.

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