黎 莉, 戴立珍, 楊 靖, 方繼德

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院, 綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430074)

0 引 言

黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XOD)是體內(nèi)核酸代謝中重要的酶, 能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化生成尿酸, 同時產(chǎn)生過氧化物自由基[1]．尿酸濃度過高將導(dǎo)致高尿酸血癥, 可引起痛風(fēng)發(fā)作．自由基涉及到炎癥等一系列病理過程[2]．因此, 抑制XOD的活性, 既可以減少體內(nèi)尿酸的形成, 有效地阻止或延緩?fù)达L(fēng)及其并發(fā)癥, 又可以減少自由基造成的組織傷害[3]．目前黃嘌呤氧化酶抑制劑(XOI)別嘌呤醇自上市后沿用至今, 是治療痛風(fēng)的主要藥物．但常伴有發(fā)熱、過敏性皮疹、腹痛、腹瀉、白細(xì)胞及血小板減少, 肝功能損害等嚴(yán)重副反應(yīng)[4]．因此, 研制開發(fā)新的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有實(shí)際意義．

黃酮類化合物廣泛存在于中草藥中, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、抗心腦血管疾病等多種藥理作用．根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[5]中黃嘌呤氧化酶抑制劑的構(gòu)效關(guān)系及應(yīng)用前景, 筆者從多種中草藥制備提取物, 這些提取物主要含有黃酮類化合物[6-7], 并進(jìn)行了體外黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

枳椇子和高良姜購于武漢市雄楚大街三九藥店, 葛花購于湖北省中醫(yī)院, 這3種藥材均經(jīng)中南民族大學(xué)萬定榮教授鑒定．枳椇子為鼠李科植物枳椇(HoveniadulcisThunb)的干燥成熟種子．高良姜為姜科植物高良姜 (AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖．葛花為豆科植物野葛[Puerarialobata(Will.)Ohwi]的干燥花．

T6-新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器公司), 帶有動力學(xué)/時間軟件． 黃嘌呤氧化酶(北京世紀(jì)山水科技公司), 黃嘌呤(Sigma公司), 槲皮素(中國藥品生物制品檢定所), 二甲基亞砜(Amresco公司), 其余試劑均為分析純．

1.2 植物提取物的制備

分別將各種植物材料粉碎成粗粉, 稱取材料10.0 g用索氏提取器進(jìn)行提取, 溶劑為不同濃度的乙醇和乙酸乙酯．提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑, 干燥剩余物, 分別得到各種提取物．

1.3 研究方法

1.3.1 溶液配制 緩沖液：取K2HPO4、KH2PO4、EDTA-2Na溶于500 mL水, 配成 0.2 mol/L 緩沖溶液 (pH7.5)．酶溶液：取黃嘌呤氧化酶, 用緩沖液配成濃度為1.144 units/mL的溶液．測試過程中利用冰袋保持低溫, 需每天配制．底物溶液：精密稱取黃嘌呤溶于水, 制得0.10 mmol/L和0.05 mmol/L底物溶液, 室溫保存．樣品和對照品溶液：精密稱取各樣品及陽性對照品槲皮素, 分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解, 得到不同濃度的溶液．

1.3.2 酶活力測定 在適宜條件下, 黃嘌呤被黃嘌呤氧化酶催化生成尿酸, 產(chǎn)物尿酸290 nm處有特征吸收峰, 因此以每分鐘290 nm處吸光度的增加來計(jì)算酶活力(dA/min)(dA為吸光度的增加值)．在任意一個適當(dāng)長的時間段內(nèi), 吸光度隨時間呈線性增加, 斜率為反應(yīng)速率(dA/min), 斜率越大, 說明酶的活力越強(qiáng), 具體操作參照文獻(xiàn)[5]．在石英比色皿中, 加入緩沖溶液、底物溶液、酶溶液, 測定290 nm處吸光度增加值, 每隔0.5 s記錄一次, 共測 1 min, 得到一條關(guān)于吸光度—時間的直線, 計(jì)算直線斜率Rate(dA/min)．

1.3.3 樣品測定 按同樣的方法, 在酶促反應(yīng)體系中加入適量樣品溶液, 每隔0.5 s記錄290 nm處吸光度變化值, 共計(jì)1 min．每個樣品平行操作3次, 取其平均值計(jì)算該樣品的抑制率．

1.3.4 空白對照 同上述操作, 加與樣品同樣體積的DMSO, 不加樣品和XOD．

1.3.5 XOD對照品測定 方法與樣品測定相同, 不加樣品．

1.3.6 陽性對照品 為核對實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果的可信性, 取已配制好的不同濃度的槲皮素溶液, 重復(fù)上述實(shí)驗(yàn), 計(jì)算IC50值．

1.3.7 抑制動力學(xué)常數(shù)Ki值的測定及計(jì)算 使用2個不同濃度的黃嘌呤溶液, 獲得不同濃度樣品溶液對XOD的反應(yīng)速率, 用Dixon繪圖法計(jì)算Ki值[8]．

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品對XOD的抑制率

計(jì)算公式為[(Rp- Rs)/Rp ] ×100%．式中 Rs、Rp分別表示樣品、XOD對照品(已減去空白對照)的反應(yīng)速率．按照上述方法進(jìn)行分析, 底物濃度為0.10 mmol/L, 樣品濃度均為100 μg/mL, 槲皮素為10 μg/mL, 得到對黃嘌呤氧化酶抑制作用較強(qiáng)的植物提取物, 分別為枳椇子乙醇提取物、高良姜乙醇提取物和葛花乙酸乙酯提取物．其抑制率如表1所示．

表1 各提取物對XOD的抑制效果

2.2 半數(shù)抑制濃度IC50

以抑制率為因變量, 以樣品濃度為自變量, 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算回歸方程．根據(jù)回歸方程計(jì)算抑制率為50%的樣品濃度IC50．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示．

2.3 Ki值計(jì)算和抑制劑類型

用Dixon繪圖法計(jì)算Ki值, 判斷抑制劑類型．在不同濃度的底物下, 以反應(yīng)速率的倒數(shù)為因變量, 樣品濃度為自變量, 得到一條直線．采用 SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算回歸方程．求出兩直線的交點(diǎn), 可得到抑制動力學(xué)參數(shù)Ki[9]．再由直線的斜率對相應(yīng)的底物濃度的倒數(shù)二次作圖, 即可判斷抑制劑類型[10]．本實(shí)驗(yàn)中的植物提取物均為競爭性抑制劑, 其動力學(xué)參數(shù)如表1和圖1～4所示．

圖1 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中枳椇子的Dixon圖

圖2 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中高良姜的Dixon圖

圖3 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中葛花的Dixon 圖

圖4 黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系中槲皮素的Dixon圖

3 討論

a．IC50值反映樣品對黃嘌呤氧化酶活性抑制的強(qiáng)弱, 該數(shù)值低則抑制作用強(qiáng)．枳椇子乙醇提取物抑制作用最強(qiáng)．Ki值是表征抑制劑對酶促反應(yīng)抑制效率的重要參數(shù), 該值越小, 則表明抑制劑對該酶促反應(yīng)抑制效果好．與化學(xué)單體槲皮素相比, 本實(shí)驗(yàn)篩選的3種提取物的IC50值和Ki值較大, 但由于提取物是混合物, 經(jīng)濟(jì)且制備容易, 還具有多重作用, 故仍然具有實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值．

b．枳椇子、高良姜和葛花屬常用中藥, 長期用于治療各種疾病, 毒性?。匆娖湟种泣S嘌呤氧化酶活性而治療痛風(fēng)的報(bào)導(dǎo)．本實(shí)驗(yàn)將對其做后續(xù)研究, 有可能發(fā)現(xiàn)其新用途, 為充分利用這些植物資源提供依據(jù)．

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