楊 菁， 劉 影， 白 劍， 樊 淼， 安 陽， 岳春麗

（遼寧醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)及新藥開發(fā)重點(diǎn)試驗(yàn)室，遼寧錦州 121001）

生地黃中梓醇純化工藝優(yōu)選

楊 菁， 劉 影， 白 劍， 樊 淼， 安 陽， 岳春麗

（遼寧醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)及新藥開發(fā)重點(diǎn)試驗(yàn)室，遼寧錦州 121001）

目的：探討生地黃中梓醇的最佳純化工藝。方法：采用高效液相色譜法檢測(cè)梓醇含量。以梓醇含量為指標(biāo)，比較不同型號(hào)的大孔樹脂、活性炭對(duì)梓醇的分離效果，再對(duì)所含梓醇的部分應(yīng)用不同的葡聚糖凝膠進(jìn)行分離。結(jié)果：優(yōu)選確定的工藝為：用15%活性炭對(duì)梓醇粗提物吸附后，活性炭用20%乙醇洗脫，將收集洗脫液濃縮后用葡聚糖凝膠G-15進(jìn)行分離，所得產(chǎn)物中梓醇含量在85%以上。結(jié)論：優(yōu)化確定的梓醇化化工藝簡(jiǎn)單可行。

生地黃；梓醇；G-15；HPLC

生地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）的干燥塊根，臨床應(yīng)用廣泛，具有滋陰補(bǔ)血、生津的功效。環(huán)烯醚萜苷類是生地黃的主要活性部位，其中梓醇含量最高。現(xiàn)代研究證明梓醇具有降血糖［1］、保護(hù)缺血再灌注受損神經(jīng)元［2］、抗癌［3］等藥理活性。但梓醇化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易受酸堿［4］等條件影響，這為梓醇的純化增加了難度，本文在地黃中梓醇提取工藝條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上［5］，應(yīng)用活性炭及葡聚糖凝膠對(duì)地黃醇提取物進(jìn)行分離，以期獲得純度較高的梓醇。

1 儀器與試藥

LC-10 Avp高效液液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)。KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器公司生產(chǎn)。A240型電子天平，美國梅特勒公司生產(chǎn)。恒溫水浴箱 ，北京市永光醫(yī)療儀器廠。生地黃，產(chǎn)自河南省武涉縣西陶鎮(zhèn)，按照2005年版《中國藥典》一部地黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，符合規(guī)定。梓醇對(duì)照品，批號(hào)110808-200407，購于中國藥品生物制品檢定所。HC-767型活性炭，杭州木材有限公司活性炭公司。大孔樹脂，天津南開化工廠生產(chǎn)；葡聚糖凝膠，美國GE公司。乙腈，美國Fish公司生產(chǎn)。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 梓醇的含量測(cè)定［6］色譜柱：日本島津VP-ODS柱，4.6 mm×150 mm；流動(dòng)相：乙腈：0.1%磷酸（1∶99）；流速：0.9 mL/min；柱溫：36℃ ；檢測(cè)波長：214 nm。

對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的梓醇對(duì)照品5.0 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液備用。

供試品溶液的制備 取供試品適量，加水至5 mL，制備成每1 mL含梓醇濃度約為每0.5 mg的溶液，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2 梓醇粗提物的制備［5］取生地黃500 g適當(dāng)粉碎，加入12倍量95%乙醇，回流提取1 h，濾過，得濾液1；藥渣中加入10倍量95%乙醇，回流提取1 h，濾過，得濾液2，合并兩次濾液，減壓濃縮至500 mL，過濾，得地黃醇提物備用。批號(hào)：C20080301、C20080302、C20080303，梓醇濃度分別為3.18、3.16、3.19 mg/mL。

2.3 梓醇的分離純化

2.3.1 活性炭對(duì)梓醇的吸附 活性炭的預(yù)處理取活性炭粉末100 g置105℃烘箱內(nèi)加熱3 h。放至室溫后備用。

活性炭的吸附能力計(jì)算 量取100 mL樣品，向其中加入15 g粉末狀活性炭，攪拌，靜置2 h，濾過，收集濾液，高效液相分別檢測(cè)濾液和活性炭吸附前藥液中梓醇含量。結(jié)果見表1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，活性炭對(duì)梓醇具有較強(qiáng)的吸附能力，平均吸附量為19.9 mg/g。

2.3.2 梓醇的洗脫 根據(jù)活性炭特點(diǎn)，選擇不同濃度的乙醇及水對(duì)活性炭進(jìn)行洗脫。

表1 活性炭的吸附量

取200 mL樣品，向其中加入30 g活性炭，攪拌，靜置2 h，濾過，收集活性炭陰干，用1 000 mL水、1 000 mL 10%乙醇、1 000 mL 20%乙醇、1 000 mL 40%乙醇、1 000 mL 95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，減壓濃縮至體積為200 mL，薄層跟蹤檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表2 不同濃度乙醇對(duì)梓醇洗脫薄層結(jié)果

表3 活性炭洗脫后梓醇的純度和收率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示10%～20%乙醇洗脫效果較好，收率在80%左右，梓醇純度約為45%，采用活性炭吸附可作為梓醇的粗分離手段。

2.3.3 梓醇的進(jìn)一步分離純化 由于活性炭洗脫液中梓醇含量在45%左右，需對(duì)其進(jìn)一步純化，參考相關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)選取3種型號(hào)的葡聚糖凝膠分別考察對(duì)梓醇的分離情況。

葡聚糖凝膠的預(yù)處理在室溫條件下，分別將將100 g葡聚糖凝膠G-15、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠LH20用5倍體積的純化水溶脹4 h，漂洗3次去除破損的膠粒，加入適量的純化水充分混勻?qū)⒛z灌入玻璃色譜柱，靜置，使其充分沉降后，用純化水平衡后，打開活塞放出多于的水，使液面略高于膠面時(shí)關(guān)閉活塞，待上樣，徑高比為1∶8。

樣品的制備 取生地黃醇提液100 mL，用活性炭吸附，先用水洗脫1 000 mL，再用20%乙醇分別洗脫2 000 mL，收集20%乙醇洗脫液，減壓濃縮至100 mL備用。

樣品的分離 取10 mL樣品，分別緩慢加到葡聚糖凝膠G-15、葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠LH20凝膠柱中，打開活塞，當(dāng)藥液面接近膠面時(shí)加水洗脫，采用部分自動(dòng)收集器進(jìn)行收集，流速為0.5 mL/min，每10 min收集一管。薄層跟蹤檢測(cè)梓醇。

通過薄層跟蹤對(duì)3種不同型號(hào)的葡聚糖凝膠對(duì)梓醇的分離效果進(jìn)行比較，由試驗(yàn)結(jié)果可見葡聚糖凝膠G-25、葡聚糖凝膠LH20對(duì)梓醇的分離效果不理想，而葡聚糖凝膠G-15能將梓醇與其他成分實(shí)現(xiàn)較好的分離。

2.3.4 梓醇分離純化驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，采用活性炭吸附、20%乙醇洗脫及G15分離的方法，對(duì)梓醇粗提物進(jìn)行了分離純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

從表4可見，工藝進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果收率能夠達(dá)到50%以上，梓醇純度能夠達(dá)到85%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)獲得的梓醇粗提物［5］的基礎(chǔ)上，首先比較了梓醇的粗提物在不同型號(hào)分別對(duì)D101、AB-8、S-5、NKA-9 四種型號(hào)大孔樹脂考察吸附量和分離效果，其中只有大孔樹脂D101對(duì)梓醇的分離效果較好，吸附量在1.002 mg/g干樹脂，但也不能充分分離梓醇與糖類?；钚蕴繉?duì)梓醇的吸附量為19 mg/g，其吸附量大于大孔樹脂，分離效果與大孔樹脂相同。由于活性炭操作簡(jiǎn)單，因此選用活性炭對(duì)梓醇進(jìn)行分離，梓醇的收率約為80%，純度在45%左右。

活性碳處理后，選用不同型號(hào)的葡聚糖凝膠對(duì)梓醇進(jìn)行分離，結(jié)果表明葡聚糖凝膠G-15分離效果好，收率高達(dá)50%以上，純度能達(dá)到85%以上。

［1］萬昌武，張雅麗，桂華珍，等，地黃不同方法提取物制劑降糖作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］，貴州醫(yī)藥，2003，27（12）：1112-1113.

［2］李 楊，李丹清，包永明，等，梓醇對(duì)缺血再灌注受損傷神經(jīng)元保護(hù)作用的研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志2005，15（10）：1454-1460.

［3］Pungitore C R，AyubM J，Borkowski E J，et al.Inhibition of Taq DNA polymerase by catalpol［J］.Cell Mol Biol，2004，50（6）：767.

［4］王宏潔，邊寶林，楊 健.地黃中梓醇變化條件的探討［J］.中國中藥雜志，1997，22（7）：408.

［5］劉 影，楊 菁，黃 雷，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選地黃中梓醇的提取工藝［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（1）：157-159.

［6］中國藥典［S］.一部，2005：82.

R284.2

A

1001-1528（2010）03-0416-03

2009-04-14

遼寧省自然科學(xué)基金（20072202）；遼寧省教育廳資助課題（20060528）；遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題（2008T115）

楊 菁（1968－），男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事腦血管疾病機(jī)制及相關(guān)藥物研究。Tel：（0416）4673465 E-mail：jzyangjing@gmail.com