孫冬梅， 畢曉黎， 莊玉堅(jiān)

（廣東省中醫(yī)研究所，廣東廣州 510095）

金刺參九正合劑HPLC指紋圖譜研究

孫冬梅， 畢曉黎， 莊玉堅(jiān)

（廣東省中醫(yī)研究所，廣東廣州 510095）

金刺參九正合劑；HPLC；指紋圖譜

目的：采用高效液相色譜法建立金刺參九正合劑（金蕎麥、刺梨、苦參）的指紋圖譜。方法：以Agilent Zorbax Extend-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.7 mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。結(jié)果：以兒茶素峰為參照物峰，確定13個(gè)共有峰，共有峰面積之和大于95%。結(jié)論：建立的方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，為該制劑的質(zhì)量控制提供了方法。

金刺參九正合劑（原愛(ài)福寧合劑）是在貴州苗族民間驗(yàn)方的基礎(chǔ)上以刺梨、苦參、金蕎麥配伍組方，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)處理精制而成的新一代抗癌藥物，具有清熱解毒、健脾生津、燥濕和胃之功，臨床作為腫瘤治療的輔助藥，取得較好療效［1］。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)制劑中苦參堿的含量進(jìn)行控制，并不能表征全方內(nèi)在質(zhì)量。為了更高地控制制劑質(zhì)量，并為其物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)，對(duì)金刺參九正合劑進(jìn)行指紋圖譜研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，四元梯度泵，G2171BA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純（Merk），水為屈臣氏蒸餾水，其它試劑均為分析純。

兒茶素（批號(hào)：877-200001）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；苦參、金蕎麥、刺梨汁藥材及金刺參九正合劑共10批（20080107、20080108、20080109、20080201、20080202、20080203、20080301、20080302、20080501、20080502）均由貴州老來(lái)福醫(yī)藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（含 0.3% 磷酸及 0.2%三乙胺）（B），采用梯度洗脫，A相梯度：0～10 min，1% ～1%；10～20 min，1% ～10%；20～40 min，10% ～30%；40～55 min，30% ～40%；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流速：0.7 mL/min；柱溫：25 ℃；運(yùn)行時(shí)間：55 min；進(jìn)樣量：7 μL。

2.2 參照峰的選擇 兒茶素（10號(hào)峰）為本方有效成分之一，在HPLC圖譜中峰面積較大，出峰時(shí)間適中且穩(wěn)定，故選擇兒茶素為參照峰。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對(duì)照品適量，加乙腈-水（1∶9）使溶解，制成每1 mL含兒茶素176 μg的溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 藥材供試品溶液的制備

刺梨：取新鮮刺梨榨汁，濾過(guò)，量取濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得刺梨供試品溶液。

金蕎麥：取金蕎麥藥材3.3 g，加70%乙醇30 mL，回流提取兩次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并提取液，濾過(guò)，濾液濃縮至約1 mL，加水溶解并定容至10 mL，10℃以下靜置24 h，取上清液，即得金蕎麥供試品溶液。

苦參：取苦參藥材1 g，加70%乙醇30 mL，回流提取兩次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并提取液，濾過(guò)，濾液濃縮至約1 mL，加水溶解并定容至10 mL，10℃以下靜置24 h，取上清液，即得苦參供試品溶液。

2.4.2 金刺參九正合劑成品供試品溶液的制備

量取本品2 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)：20080203）制劑的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性，結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.13% ～0.77%，相對(duì)峰面積的RSD為1.92% ～2.90%，表明本方法儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)：20080203）制劑的供試品溶液，分別在 0、1.5、3、6、9 h 進(jìn)樣，測(cè)定，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性，結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.11% ～0.85%，相對(duì)峰面積的RSD為1.36% ～3.28%，沒(méi)有明顯變化，顯示供試品溶液在9h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)：20080501）樣品，按照供試品溶液的制備方法，制備5份供試品溶液，依次進(jìn)行測(cè)定，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性，結(jié)果表明各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.08%～2.48%，相對(duì)峰面積的RSD為1.23% ～2.95%，RSD<3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 樣品測(cè)定 取10批金刺參九正合劑樣品，分別按2.4.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，再按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC指紋圖譜測(cè)定。根據(jù)10批供試品溶液HPLC提供的相關(guān)參數(shù)，確定共有峰為13個(gè)，并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)示。為了便于辨認(rèn)和分析比較，將整個(gè)色譜圖分成Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)區(qū)。指紋峰的位置：第一區(qū)包括1#～8#峰（保留時(shí)間范圍3～11 min）；第二區(qū)包括9#～13#峰（保留時(shí)間范圍21～42 min），見(jiàn)圖1。相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、2。

圖1 金刺參九正合劑特征指紋圖譜

表1 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表2 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

2.6.2 指紋圖譜相似度計(jì)算 將10批樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版），設(shè)定匹配模板，進(jìn)行譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（見(jiàn)圖2），進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，以平均數(shù)計(jì)算，分別為：0.998、0.998、0.999、0.998、0.996、0.998、0.998、0.998、0.998、0.997；以中位數(shù)計(jì)算，分別為 0.997、0.998、1.000、0.996、0.996、0.996、0.997、0.998、0.999、0.995，均大于0.99。表明10批樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度良好，本制劑工藝穩(wěn)定。

2.6.3 指紋圖譜各共有峰歸屬的初步判斷 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，藥材供試品和制劑供試品溶液各7 μL分別進(jìn)樣，通過(guò)與指紋圖譜保留時(shí)間和紫外光譜對(duì)照，確定了10號(hào)峰（S）為兒茶素。另外通過(guò)各單味藥材與復(fù)方制劑指紋圖譜的對(duì)照分析，基本確定了各味藥材對(duì)該方的貢獻(xiàn)。其中共有峰1#峰、8#峰來(lái)自于金蕎麥藥材，9#峰、13#峰來(lái)自于苦參藥材，2#峰、3#峰、4#峰、7#峰來(lái)自于刺梨藥材。計(jì)算各批號(hào)樣品共有峰的面積，結(jié)果表明，10批供試品的共有峰面積之和均大于總峰面積的95%，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 10批金刺參九正合劑指紋圖譜

2.6.4 苦參中苦參堿的含量測(cè)定 為了控制金刺參九正合劑的質(zhì)量，還按照《中國(guó)藥典》2005年版一部苦參項(xiàng)下含量測(cè)定方法對(duì)樣品中苦參主要成分苦參堿的含量進(jìn)行了測(cè)定，所得色譜圖峰形較好，分離度高，苦參堿的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 10批金刺參九正合劑特征指紋峰的峰面積之和/%

表4 苦參堿含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)上述研究確定了金刺參九正合劑供試品制備方法和色譜條件，并驗(yàn)證了精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，結(jié)果令人滿意；建立了金刺參九正合劑指紋圖譜，確定了其中13個(gè)主要特征峰。

13 個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間為：峰1（0.135～0.136）；峰2（0.146～0.147）；峰 3（0.165～0.166）；峰 4（0.180～0.181）；峰 5（0.234～0.237）；峰 6（0.265～0.272）；峰7（0.336～0.338）；峰 8（0.376～0.380）；峰 9（0.802～0.804）；峰10（1.000）；峰11（1.145～1.146）；峰12（1.339～1.350）；峰13（1.525～1.529）。

13 個(gè)共有色譜峰的相對(duì)峰面積為：峰1（0.555～0.660）；峰2（11.815～14.993）；峰3（1.159～1.378）；峰4（0.498～0.582）；峰 5（0.400～0.457）；峰 6（0.502～0.612）；峰7（2.739～3.248）；峰 8（0.796～0.969）；峰 9（1.367～1.792）；峰10（1.000）；峰11（1.571～1.880）；峰12（1.420～1.662）；峰13（3.810～4.605）。

根據(jù)研究結(jié)果，制定了金刺參九正合劑指紋圖譜的技術(shù)參數(shù)，通過(guò)對(duì)其指紋圖譜相似度的計(jì)算，10批樣品的相似度都在0.99以上。因此，本方法可作為評(píng)價(jià)金刺參九正合劑質(zhì)量的指紋圖譜，同時(shí)為進(jìn)行其物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 討論

4.1 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)中曾選擇4種流動(dòng)相系統(tǒng)：以乙腈-水，乙腈-水-無(wú)水乙醇，乙腈-0.3%磷酸，乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，以乙腈-水，乙腈-水-無(wú)水乙醇，乙腈-0.3%磷酸為流動(dòng)相系統(tǒng)，供試品溶液中組分分離不理想；采用乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）體系，色譜峰尖銳無(wú)拖尾，且基線在同一趨勢(shì)下重復(fù)性較好，故選擇乙腈-水（含0.3%磷酸及0.2%三乙胺）系統(tǒng)為流動(dòng)相［2］。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3-4］，運(yùn)用Agilent 1200高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器分別在210、220、230、254、280、365 nm對(duì)金刺參九正合劑主要成分吸收波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果在220 nm處吸收峰呈現(xiàn)較完全，因此確定，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

4.3 按照國(guó)家藥典委員會(huì)關(guān)于“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）的通知”，以HPLC梯度洗脫法對(duì)金刺參九正合劑進(jìn)行指紋圖譜研究，實(shí)驗(yàn)證明，該方法可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為金刺參九正合劑指紋圖譜研究［5］。

［1］趙新環(huán)，謝正富.苗族方藥“愛(ài)福寧合劑”的抗癌作用［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2002，57：223-225.

［2］王欣之，文紅梅，居玲玲，等.玉屏風(fēng)散醇提部位HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31（3）：335-339.

［3］何美珊，錢炳輝，王兆龍，等.金蕎麥HPLC指紋圖譜的研究［J］. 中國(guó)藥師，2005，8（3）：217.

［4］馬仁玲，周紅華，于喜水，等.苦參注射液生物堿類成分指紋圖譜的研究［J］. 中國(guó)中藥雜志，2003，28（9）：817-819.

［5］孫守國(guó).復(fù)方丹參片的HPLC指紋圖譜研究［J］.中成藥，2009，31（3）：339-342.

R284.1

A

1001-1528（2010）07-1096-03

2009-06-12

孫冬梅（1969－），女，主任中藥師，主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。Tel：（020）83501292 E-mail：tcmgdp@163.com