翟慶峰，劉洪濤，李媛媛，馬 強(qiáng)

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261042;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050;3.濰坊市婦幼保健院，山東 濰坊 261011)

1993年Marber等發(fā)現(xiàn)，心肌缺血預(yù)適應(yīng)(ischemia preconditioning，IPC)的心臟保護(hù)作用在1～2 h即消失，但其后 24h又可重現(xiàn)，因此指出IPC存在早期預(yù)適應(yīng)(early preconditioning，EPC)和延遲預(yù)適應(yīng)(delayed preconditioning，DPC)。由于DPC具有較長的保護(hù)作用時相而更具有應(yīng)用價值。Hangaishi等[1]發(fā)現(xiàn)鼠經(jīng)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后，血紅素氧合酶-1(HO-1)和HO-1 mRNA皆顯著增加，證實(shí)作為一種內(nèi)源性熱休克蛋白(HSP)，HO-1對心肌I/R起保護(hù)作用。但HO-1在DPC中是否也作為效應(yīng)蛋白起保護(hù)作用，尚未見報道。因此本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞水平對此問題進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

新生1～5 d的Wistar大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生與環(huán)境研究所動物中心提供)，剪取心臟，用含20%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度1.0～4.0×106cells/ml)接種于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后選自律性搏動大于100beats/min的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

參考Shiono等[2]的方法，取培養(yǎng)5 d的心肌細(xì)胞，用 PBS沖洗3次后向培養(yǎng)瓶中加入已用氮飽和的D-Hanks液，置于缺氧干燥瓶中，以5 L/min流量向干燥瓶內(nèi)持續(xù)充入95%氮?dú)?5%CO2，測氧濃度＜1%，即“缺血”，將D-Hanks液換成含20%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于95%的空氣+5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即“再灌注”。按上述“缺血”、“再灌注”方法，行10min“缺血”，10min“再灌注，如此反復(fù) 4次，模擬細(xì)胞缺血預(yù)適應(yīng)”。24h后缺血2 h，再灌注 1 h，即為“I/R”。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

(1)對照組(CN):正常培養(yǎng)30h。(2)缺血/再灌注組(I/R):正常培養(yǎng)27 h后行缺血2 h，再灌注1 h。(3)缺血預(yù)適應(yīng)+缺血/再灌注組(IPC+I/R，以PC表示):正常培養(yǎng)1 h后行10min“ 缺血” ，10min“ 再灌注” ，如此反復(fù) 4次，24h 后行缺血2 h，再灌注1 h。(4)HO-1抑制劑+缺血預(yù)適應(yīng)+缺血/再灌注組(ZnPP+IPC+I/R，以ZP表示):加入HO-1抑制劑 ZnPP(終濃度 10μmol/L)，1 h 后行 10min“缺血” ，10min“再灌注，如此反復(fù)4次，24h后行缺血2h，再灌注1 h。(5)HO-1誘導(dǎo)劑+缺血/再灌注組(hemin+I/R，以HE表示):加入HO-1誘導(dǎo)劑hemin(終濃度10μmol/L)，24h后行缺血 2 h，再灌注1 h。

1.4 指標(biāo)測定及方法

1.4.1 RT-PCR法測定HO-1mRNA表達(dá) 參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南提取心肌細(xì)胞總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。結(jié)果用擴(kuò)增條帶與β-actin條帶的灰度值表示。

1.4.2 MTT法測定細(xì)胞存活率 按細(xì)胞密度1×105cells/ml，100μl/well將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。各組實(shí)驗(yàn)實(shí)施如前所述，過24h后用MTT法測定細(xì)胞存活率。

1.4.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量的測定 按細(xì)胞密度1×105cells/ml，130μl/well將細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板中。 各組實(shí)驗(yàn)實(shí)施如前，培育5 h后參照改良硫代巴比妥酸法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中脂質(zhì)過氧化物含量，以MDA含量表示心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度。

1.4.4 熒光分光光度計(jì)測定心肌細(xì)胞胞內(nèi)[Ca2+]i 細(xì)胞種于25 ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度3×106cells/ml，2.5 ml/瓶。 各組實(shí)驗(yàn)實(shí)施如前，參照Terry[3]的方法用熒光分光光度計(jì)測定心肌細(xì)胞胞內(nèi)[Ca2+]i。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞HO-1mRNA表達(dá)量的變化

除ZP組(0.48±0.05)外，各組心肌細(xì)胞中HO-1 mRNA表達(dá)量均明顯高于CN組(0.53±0.03，P＜0.05)，PC組(1.76±0.14)和HE組(1.58±0.21)又顯著高于IR組(0.89±0.09，P＜0.05)和ZP組(圖1)。

Fig.1 Levels of HO-1 mR NA in myocardial cells subjected to the I/R injury

2.2 HO-1對心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量及心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響

各組再灌注后心肌細(xì)胞存活率、MDA含量和胞內(nèi)Ca2+含量皆具有顯著性差異。組間比較:與CN組比較，I/R組、PC組和ZP組再灌后細(xì)胞存活率顯著降低，MDA含量和胞內(nèi)[Ca2+]i顯著升高;與I/R組比較，PC組和HE組細(xì)胞存活率顯著升高，MDA含量和胞內(nèi)[Ca2+]i皆顯著降低;PC與ZP組間有顯著性差異，與HE組比較未見顯著性差異(表1)。

Tab.1 Effects ofHO-1 onthe cell survival rate，theMDA concentration in cell culture medium and the[Ca2+]i in cell(，n=8)

Tab.1 Effects ofHO-1 onthe cell survival rate，theMDA concentration in cell culture medium and the[Ca2+]i in cell(，n=8)

CN:Control group;I/R:I/R group;PC:IPC+I/R group;ZP:HO-1 inhibitor ZnPP+IPC+I/R group;HE:HO-1 inductor hemin+I/R group*P＜0.05 vs CN;#P＜0.05 vs I/R;△P＜0.05 vs PC

Group Cell survival rate(%) MDA(μmol/L) [Ca2+]i(nmol/L)CN 94.22±4.25 10.70±2.61 112.20±47.59 I/R 51.91±5.11* 51.42±15.83* 1633.34±377.89*PC 80.45±12.63*# 21.59±4.01*# 349.40±55.48*#ZP 63.73±12.15*△ 38.22±10.70*#△ 811.06±86.66*△HE 81.16±10.71*# 18.21±3.07*# 249.25±53.95#

3 討論

內(nèi)源性信號傳導(dǎo)因子CO的發(fā)現(xiàn)促使人們對HO的心肌保護(hù)作用進(jìn)行了深入的研究。而DPC是迄今為止最有效的保護(hù)心肌I/R損傷的內(nèi)源性保護(hù)措施，為證實(shí)DPC是否能誘導(dǎo)HO-1的高表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)對心肌細(xì)胞HO-1mRNA進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R損傷后，HO-1mRNA表達(dá)顯著增加，而如果于I/R損傷前24h行IPC，則HO-1mRNA進(jìn)一步顯著增加，表明IPC可能作為刺激因素較I/R損傷更能引起心肌HO-1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，此結(jié)果與Hangaishi等[1]及易凌等[4]研究結(jié)果基本一致。另外，本實(shí)驗(yàn)還人為地加入了HO-1抑制劑和誘導(dǎo)劑，造成了HO-1不同的表達(dá)梯度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果在IPC前加入HO-1抑制劑ZnPP，則 HO-1mRNA顯著降低，而加入誘導(dǎo)劑hemin后行I/R，則HO-1mRNA維持一個較高表達(dá)水平，由此推測，HO-1與IPC兩者有著密切的關(guān)系。

為了證實(shí)HO-1在DPC中對I/R損傷是否起作用，本實(shí)驗(yàn)測定了心肌細(xì)胞存活率、胞內(nèi)[Ca2+]i和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R損傷可引起心肌細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷和鈣超載，使得心肌細(xì)胞存活率顯著下降，而IPC和HO-1誘導(dǎo)劑則可顯著降低脂質(zhì)過氧化損傷和胞內(nèi)鈣離子濃度，保護(hù)心肌細(xì)胞，但如果在 IPC前加入HO-1抑制劑，則IPC的延遲保護(hù)作用將被消除，表明IPC確實(shí)對心肌細(xì)胞的I/R損傷具有延遲保護(hù)作用，而HO-1在這一延遲保護(hù)作用中起著積極的作用。

實(shí)驗(yàn)表明，IPC可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞HO-1mR NA表達(dá)增多，對24h后發(fā)生的心肌I/R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。但HO-1是如何參與IPC對心肌I/R損傷的延遲保護(hù)作用，以及IPC是如何激發(fā)HO-1的，這些問題將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入的探討。

[1]Hangaishi M，Ishizaka N，Aizawa T，et al.Induction of heme oxygenase-1 can act protectively against cardiac ischemia/reperfusion in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，279(2):582-588.

[2]Shiono N，Rao V，Weisel R D，et al.L-arginine protectshuman heart cells from low-volume anoxia and reoxygenation[J].AmJ Physiol Heart Physiol，2002，282(3):H805-815.

[3]Terry C M，Clikeman JA，Hoidal J R，et al.TNF-αand IL-1αinduce heme oxygenase-1 via protein kinase C，Ca2+，and phospholipase A2 in endothelial cells[J].Am J Physiol，1999，276(5):H1493-1501.

[4]易 凌，王天輝，劉洪濤.血紅素氧合酶-1 mRNA在離體大鼠心肌缺血預(yù)處理中的變化[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2004，20(3):252-253.