張 沂，王 強(qiáng)，蔡清宇，任婷麟，于春令，郝 特，吳 迪

（海軍總醫(yī)院藥劑科，北京市 100048）

復(fù)方苦芩軟膏是我院藥劑科自主研制的外用乳膏劑，具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應(yīng)及保護(hù)創(chuàng)面、潤(rùn)滑皮膚的作用，臨床用于海洋生物蟄傷、蚊蟲(chóng)咬傷等癥的治療。為了保證制劑質(zhì)量，筆者采用薄層色譜（TLC）法對(duì)軟膏中蘆薈苷、黃芩苷、薄荷腦3種成分進(jìn)行定性鑒別；用高效液相色譜（HPLC）法在同條件下，測(cè)定該制劑中有效成分延胡索乙素、黃芩苷的含量。本法具有方便快捷、準(zhǔn)確和重復(fù)性好的特點(diǎn)，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A HPLC儀，包括LC-10AD泵、CTO-10A柱溫箱、CLASS-VP工作站（日本島津公司）；AT-261型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Telode公司）；ME-2155型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Suiropras公司）；KQ-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DGG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；CX41型掃描電鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

復(fù)方苦芩軟膏（規(guī)格：每支15 g，批號(hào)：090625、090702、090728）及陰性樣品由海軍總醫(yī)院提供；延胡索乙素（批號(hào)：110726-200610）、黃芩苷（批號(hào)：110715-200815）、蘆薈苷（批號(hào)：110787-200303）、苦參堿（批號(hào)：110805-200507）、薄荷腦（批號(hào)：110728-200506）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 蘆薈苷的TLC鑒別 取本品1 g，加無(wú)水乙醇30 mL，超聲30 min，濾過(guò)，揮干，加無(wú)水乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液；另取蘆薈苷[1]對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，在365 nm紫外燈光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。蘆薈苷的TLC見(jiàn)圖1。

2.1.2 黃芩苷的TLC鑒別 取本品1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）混合液30 mL，超聲30 min，濾過(guò)，蒸干，加無(wú)水乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液；另取黃芩苷[3]對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。黃芩苷的TLC見(jiàn)圖2。

圖1 蘆薈苷的TLC1～3.供試品；4.陰性對(duì)照；5.蘆薈苷對(duì)照品Fig 1 TLC of alion1～3.test sample；4.negative control；5.alion control

2.1.3 薄荷腦的TLC鑒別 取“2.1.1”項(xiàng)下的供試品溶液為供試品溶液；另取薄荷腦[4]對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯（85∶15）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。薄荷腦的TLC見(jiàn)圖3。

圖2 黃芩苷的TLC1～3.供試品；4.黃芩苷對(duì)照品；5.陰性對(duì)照Fig 2 TLC of baicalin1～3.test sample；4.baicalin control；5.negative control

圖3 薄荷腦的TLC1～3.供試品；4.薄荷腦對(duì)照品；5.陰性對(duì)照Fig 3 TLC of menthol1～3.test sample；4.menthol control；5.negative control

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbox Edipse-XDB C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：5μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品，加95%乙醇制成每1 mL含0.131 mg的溶液，即得延胡索乙素對(duì)照品溶液；精密稱取黃芩苷對(duì)照品，加95%乙醇制成每1 mL含0.1007 mg的溶液，即得黃芩苷對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品適量，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入95%乙醇溶液100 mL，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）15 min，用95%乙醇補(bǔ)足失重，樣品冷浸12 h后，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 空白試驗(yàn) 按處方中藥的比例，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備不含延胡索乙素及黃芩苷的陰性對(duì)照溶液，并按上述方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，在延胡索乙素及黃芩苷的色譜峰處均未發(fā)現(xiàn)吸收峰，表明無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.延胡索乙素對(duì)照品；B.黃芩苷對(duì)照品；C.供試品；D.陰性對(duì)照；1.延胡索乙素；2.黃芩苷Fig 4 HPLC chromatogramsA.tetrahydropalmatine control；B.baicalin control；C.test samples；D.negative control；1.tetrahydropalmatine；2.baicalin

2.2.5 線性關(guān)系考察 （1）精密稱取延胡索乙素對(duì)照品適量，加95%乙醇制成每1 mL含0.655 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液0.4、0.8、1.2、2.0、4.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取對(duì)照品溶液各5 μL，注入HPLC儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，延胡索乙素進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝921919X+9609.1（r＝0.9999）。結(jié)果表明，延胡索乙素進(jìn)樣量在0.131～3.275 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。（2）精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，加95%乙醇制成每1 mL含1.007mg的溶液，作為對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取對(duì)照品溶液各5 μL，注入HPLC儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，黃芩苷進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝3000000X－33326（r＝0.9999）。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.05035～2.014 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)：090728），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果，延胡索乙素的RSD＝0.38%，黃芩苷的RSD＝0.15%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，本方法有良好的穩(wěn)定性。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：090728），按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定其含量。結(jié)果，延胡索乙素的RSD＝0.97%，黃芩苷的RSD＝2.00%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)090728，延胡索乙素含量：17.91mg·g-1，黃芩苷含量：19.00 mg·g-1）約2.500 g（6份），精密稱定，分別精密加入延胡索乙素對(duì)照品及黃芩苷對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法操作，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.2.9 樣品含量測(cè)定 依“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依相同色譜條件，以外標(biāo)法計(jì)算3批樣品（批號(hào)：090625、090702、090728）的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中延胡索乙素及黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of tetrahydropalmatine and baicalin in samples（n＝3）

3 討論

3.1 關(guān)于TLC鑒別

在本次復(fù)方苦芩軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究過(guò)程中，經(jīng)多方資料查詢及反復(fù)試驗(yàn)篩選研究，選出上述幾種無(wú)干擾且重復(fù)性好的藥味鑒別，且提取和鑒別方法均簡(jiǎn)便有效。經(jīng)多批樣品驗(yàn)證，均能檢出與對(duì)照品相同的斑點(diǎn)，在TLC方面為本制劑提供了比較全面準(zhǔn)確的質(zhì)量控制方法。其中，蘆薈苷易氧化，供試品制備后應(yīng)盡快點(diǎn)樣鑒別。

3.2 前處理?xiàng)l件的選擇

試驗(yàn)中在對(duì)溶劑的選擇上，比較了甲醇和95%乙醇、95%乙醇冷浸12 h的處理效果。結(jié)果表明，3種方法的效果差別不大，但乙醇的毒性小，且冷浸后能更好地將乳膏中的基質(zhì)除去，故選擇95%乙醇冷浸12 h的處理方法。對(duì)于提取溶劑量的選擇，試驗(yàn)中分別采用95%乙醇25、50、100、200 mL進(jìn)行提取，分別測(cè)定單位質(zhì)量延胡索乙素和黃芩苷峰面積。結(jié)果表明，95%乙醇100 mL提取延胡索乙素和黃芩苷均為最優(yōu)，能將有效成分提取完全。為更好地除去乳膏中的基質(zhì)，試驗(yàn)比較了硅藻土柱和聚酰胺柱的處理效果。結(jié)果表明，2種方法均對(duì)所測(cè)成分有吸附，故不采用該法，而選用95%乙醇冷浸12 h的處理方法。

3.3 耐用性試驗(yàn)

試驗(yàn)中，選用乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）、乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）、乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）3種流動(dòng)相進(jìn)行比較。圖譜顯示，選用乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）的圖譜，圖中峰型較寬；選用乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）的圖譜，兩峰間距較窄；而選用乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）的圖譜，分離效果最好。最終選定乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）流動(dòng)相系統(tǒng)，使延胡索乙素和黃芩苷達(dá)到基線分離。

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[2]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄31.

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[4]張良曉.高效液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古石油化工，2005，7：3.