施潔明，何仲貴（1.廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣州市 510160；.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽市 110016）

桂利嗪（Cinnarizine）為二苯哌嗪類鈣離子拮抗劑[1]，它直接擴(kuò)張血管平滑肌，顯著改善腦循環(huán)和冠循環(huán)，該藥目前主要用于心絞痛及腦血循環(huán)障礙。目前，國(guó)內(nèi)、外對(duì)桂利嗪的劑型研究并不完善，《中國(guó)藥典》現(xiàn)收載的只有片劑和膠囊劑這2種口服固體制劑。而從臨床使用方面來看，注射劑起效更快、療效更好，所以有必要研究和制備桂利嗪注射劑。桂利嗪在水中幾乎不溶，而2-羥丙基-?-環(huán)糊精作為新型的注射用輔料對(duì)桂利嗪有良好的增溶作用[2]，同時(shí)避免了使用有機(jī)溶媒所導(dǎo)致的刺激性和毒副作用。筆者在前期成功制備桂利嗪注射劑的基礎(chǔ)上，以大鼠為模型動(dòng)物，采用高效液相色譜熒光法測(cè)定了桂利嗪靜脈注射給藥后的血藥濃度，并研究了其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀、RF-10AXL熒光檢測(cè)器（日本島津公司）。

1.2 試藥

桂利嗪對(duì)照品（廣東麗珠集團(tuán)利民制藥廠，批號(hào)：20030302，純度：99.2%）；內(nèi)標(biāo)鹽酸氟桂利嗪（江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)：000626，純度：99.5%）；桂利嗪注射液（沈陽藥科大學(xué)藥劑教研室，批號(hào)：030508，規(guī)格：20 mg·2 mL－1）；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠，♂，200～250 g，沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2003-008。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方案

取大鼠6只，禁食過夜，自由飲水。頸靜脈插管給藥，劑量為3 mg·kg－1。于給藥后5、10、20、40、60、120、240 min時(shí)靜脈取血0.5 mL，肝素抗凝，4000 r·min－1離心10 min，取0.1 mL血漿備用。

2.2 色譜條件[3]

色譜柱：Diamond C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol·L－1磷酸二氫銨（50∶50，用磷酸調(diào)至pH至5.7）；流速：1.5 mL·min－1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)260 nm，發(fā)射波長(zhǎng)315 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 對(duì)照品貯備液和內(nèi)標(biāo)溶液配制

精密稱取桂利嗪對(duì)照品適量，用甲醇溶解并制成0.1 mg·mL－1貯備液；另取鹽酸氟桂利嗪適量，用甲醇溶解并制備成600 ng·mL－1的溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 血樣處理

取0.1 mL血漿置于10 mL具塞玻璃離心試管中，加入內(nèi)標(biāo)100 μL和0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液100 μL，用渦旋混合器振蕩1 min，加入乙醚1 mL，渦旋振蕩2 min，10000 r·min－1離心5 min，收集上清液置于另一具塞玻璃離心試管中，下層液體用乙醚1 mL再提取1次，合并上清液，于40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，加?00 μL流動(dòng)相，渦旋2 min，10000 r·min－1離心2 min，取20 μL進(jìn)樣。

2.5 方法專屬性

取空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)+對(duì)照品、靜脈注射后血漿樣品（10 min）按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，各色譜峰分離情況見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)+對(duì)照品；C.血漿樣品；1.桂利嗪；2.內(nèi)標(biāo)Fig 1 HPLC chromatographyA.blank plasma；B.blank plasma spiked with internal standard and cinnarizine control；C.plasma sample；1.cinnarizine；2.internal standard

圖1結(jié)果表明，桂利嗪與內(nèi)標(biāo)之間分離良好，色譜峰形對(duì)稱，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的色譜峰很小，對(duì)桂利嗪和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無干擾。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將對(duì)照品貯備液制備成不同濃度，加入空白血漿中，使其在血漿中濃度分別為10、50、100、250、500、1000 ng·mL－1，按“2.4”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖、樣品峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）。以R＝As/Ai計(jì)算不同濃度的R值，用R對(duì)血藥濃度C進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程R＝0.0023C+0.0269（r＝0.9996）。結(jié)果表明，桂利嗪檢測(cè)濃度線性范圍為10～1000 ng·mL－1。按信噪比為3∶1，最低檢測(cè)限為0.2 ng·mL－1。

2.7 提取回收率試驗(yàn)

取空白血漿制備含桂利嗪分別為20、500、1000 ng·mL－1的血漿對(duì)照樣品，每個(gè)濃度平行配制5份，按“2.4”項(xiàng)下操作，以提取后的色譜峰面積與同濃度溶液直接進(jìn)樣所得的峰面積之比作為提取回收率。結(jié)果，提取回收率分別為95.9%、98.2%、98.6%，RSD分別為1.5%、1.1%、3.2%。取內(nèi)標(biāo)溶液100 μL加入到0.1 mL空白血漿中，制備5份，按“2.4”項(xiàng)下操作，以提取后的色譜峰面積與同濃度內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣所得的峰面積之比作為內(nèi)標(biāo)提取回收率。結(jié)果，內(nèi)標(biāo)提取回收率為96.3%，RSD＝1.8%。

2.8 精密度試驗(yàn)

取空白血漿制備含桂利嗪分別為20、500、1000 ng·mL－1的血漿對(duì)照樣品，按“2.4”項(xiàng)下操作進(jìn)行分析測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3 d。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD分別為5.4%、4.7%、6.8%，日間精密度RSD分別為5.1%、3.6%、8.6%。表明日內(nèi)、日間精密度均符合生物樣品分析的要求（RSD＜15%）。

2.9 血漿樣品的穩(wěn)定性考察

制備濃度分別為20、500、1000 ng·mL－1的桂利嗪血漿樣品數(shù)份，室溫放置10 h后按“2.4”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定，計(jì)算桂利嗪濃度。結(jié)果3個(gè)濃度樣品的RSD均＜10%，表明樣品在室溫條件下10 h內(nèi)穩(wěn)定。將上述3個(gè)濃度的血漿樣品冰凍貯藏，并分別于10、20、30 d取出解凍，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定。結(jié)果3個(gè)濃度樣品的RSD均＜10%，表明樣品在冰凍條件下30 d穩(wěn)定。另取冰凍貯藏后的3個(gè)濃度血漿樣品，室溫融化，重復(fù)凍融3次，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定。結(jié)果3個(gè)濃度樣品的RSD均＜10%，表明樣品在凍融過程中穩(wěn)定。

2.10 血藥濃度及藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

大鼠給藥后桂利嗪平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2 靜脈注射給藥后桂利嗪平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of cinnarizine after intravenous injection（n＝6）

根據(jù)消除相末端直線部分的斜率計(jì)算t1/2，AUC0～240min由梯形法求得。結(jié)果t1/2為（87.73±22.54）min，AUC0～240min為（58453±8672.8）ng·min·mL－1。

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇

本文首次采用鹽酸氟桂利嗪作為內(nèi)標(biāo)物來測(cè)定桂利嗪的血藥濃度，兩者性質(zhì)和結(jié)構(gòu)均相似，保留時(shí)間相近，在本文實(shí)驗(yàn)條件下10 min內(nèi)可獲得良好的分離度，且桂利嗪和內(nèi)標(biāo)的色譜峰形均令人滿意。

3.2 檢測(cè)器的選擇

桂利嗪的給藥劑量較小，為每日20 mg，所以血藥濃度較低，在紫外檢測(cè)器下響應(yīng)值較小，藥物進(jìn)入血液后很快就被消除因而無法檢出，以至于無法獲得完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。筆者利用桂利嗪和內(nèi)標(biāo)均具有熒光的特點(diǎn)，選用熒光檢測(cè)器來提高檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的熒光檢測(cè)法靈敏度高，最低檢測(cè)限為0.2 ng·mL－1。

3.3 血漿處理?xiàng)l件的選擇

筆者曾選用正己烷[4]、氯仿、乙酸乙酯[5]、乙醚等提取溶劑，發(fā)現(xiàn)前2種溶劑提取時(shí)易發(fā)生乳化現(xiàn)象，乙酸乙酯提取后內(nèi)源性雜質(zhì)較多，對(duì)測(cè)定有干擾。本文首次采用乙醚作為提取溶劑，結(jié)果未發(fā)生乳化現(xiàn)象，且選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、毒性較小、提取回收率高且穩(wěn)定，是桂利嗪體內(nèi)藥物分析較好的方法。

[1]孫定人，張石革，梁三江.國(guó)家臨床新藥集[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2001：230～231.

[2]施潔明，何仲貴，劉曉紅，等.2-羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)桂利嗪的增溶作用[J].中國(guó)新藥雜志，2004，13（3）：233.

[3]李 揚(yáng)，王 威，劉 蕾，等.鹽酸氟桂利嗪片人體生物等效性研究[J].中國(guó)藥房，2000，11（3）：120.

[4]劉玉旺，孫培紅，趙 俠，等.氟桂利嗪膠囊的人體生物等效性研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2001，17（4）：277.

[5]湯麗芬，吳玨珩，李莉春，等.用反相高效液相色譜法測(cè)定人體血漿中鹽酸氟桂利嗪含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2000，19（6）：75.