房志剛，陳亞根，張健康，魏妙，張學(xué)農(nóng)，2#（.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州市 2523；2.蘇州利元醫(yī)藥科技有限公司，蘇州市 25002）

環(huán)孢素A（Cyclosporine A，CyA）為第3代強(qiáng)效免疫抑制劑，已成功應(yīng)用于腎臟、肝臟和心臟等器官移植手術(shù)前、后機(jī)體的排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療，自其臨床應(yīng)用以來，CyA顯著改善了實體器官移植的近期存活率，在器官移植史上具有劃時代的意義。目前臨床上常用的CyA制劑，如新山地明微乳制劑（Neoral）含有增溶劑Cremophor EL，可刺激組胺釋放，引起超敏反應(yīng)[1]。納米粒給藥系統(tǒng)以其獨(dú)特的吸收機(jī)制和藥物保護(hù)作用等，受到國內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注，并取得了較為顯著的成果。因此，筆者制備了CyA納米粒（CyANP）給藥系統(tǒng)，所用載體材料為腸溶材料Eudragit S100。該制劑可將藥物定位輸送到小腸特定部位，有效減少胃腸道酶系對藥物的代謝作用，并促進(jìn)藥物吸收，其在大鼠體內(nèi)的相對生物利用度為162.1%[2]，并且由于不含增溶劑Cremophor EL，可顯著降低過敏反應(yīng)。

同時，由于目前國內(nèi)、外文獻(xiàn)對CyA-NP在體內(nèi)組織分布的研究少有報道，大多研究其在動物體內(nèi)的相對生物利用度。因此，本文以Neoral為參比制劑，對小鼠口服灌胃給藥后CyA-NP在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)和組織分布做進(jìn)一步研究。

1 材料

1.1 儀器與試藥

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；Vivaflow50超濾儀（10000Da聚砜醚濾膜，德國賽多利斯公司）；MS3 digital渦旋器（德國IKA公司）；低速大容量多管離心機(jī)（無錫市瑞江分析儀器有限公司）；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；SHZ-82型恒溫振蕩箱（金壇富華儀器有限公司）。

CyA（批號：0608019（N），純度：＞99.3%）、內(nèi)標(biāo)環(huán)孢素D（CyD，含量：＞96.5%）均由福建科瑞藥業(yè)有限公司提供；Eudragit S100（德國R?hm公司）；Neoral（諾華制藥有限公司，批號：S0049，規(guī)格：每粒25 mg）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水系三蒸水。

1.2 動物

清潔級昆明種小鼠，♂，體質(zhì)量18～24 g，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（蘇）2007-0035。

2 方法與結(jié)果

2.1 CyA-NP的制備[3]

精密量取泊洛沙姆125 mg，加入125 mL蒸餾水溶解作為水相；另取CyA50 mg、200 mg Eudragit S100，加無水乙醇50 mL制成有機(jī)相；以7#骨髓穿刺針迅速將有機(jī)相注入以400 r·min－1轉(zhuǎn)速攪拌的水相中。注射完畢后繼續(xù)攪拌10 min，轉(zhuǎn)入60℃水浴中，攪拌3 h以揮發(fā)有機(jī)溶劑，即得CyA-NP膠體溶液，并進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量評價。

結(jié)果，CyA-NP的粒徑分布為單峰分布，粒徑分布范圍為22～100 nm，平均粒徑為（43.9±0.82）nm。包封率為（98.3±0.2）%，載藥量（23.9±0.1）%，回收率（97.3±0.3）%。

2.2 生物樣品中CyA的濃度測定

2.2.1 色譜條件。色譜柱：HYPERSIL-BDS C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇/水＝55∶45（1/1）；流速：1.3 mL·min－1；檢測波長：210 nm；柱溫：70 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

在上述色譜條件下，取空白全血、含藥全血+CyD、空白心臟、含藥心臟組織勻漿液樣品+CyD進(jìn)樣分析，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白全血；B.含藥全血+CyD；C.空白心臟；D.含藥心臟+CyD；1.CyA；2.CyDFig 1 HPLC chromatographyA.blank blood；B.blood sample+CyD；C.blank heart；D.heart sample+CyD；1.CyA；2.CyD

圖1結(jié)果表明，小鼠血液及各組織勻漿液中內(nèi)源性物質(zhì)基本上不干擾CyA和內(nèi)標(biāo)CyD的測定，處理過程未引入新的雜質(zhì)，在此色譜條件下CyA和CyD達(dá)到基線分離。

2.2.2 生物樣品的處理方法[4]。取小鼠心臟、肝、脾、肺、腎各組織樣品，精密稱定，按10 mL·g－1加水，高速電動勻漿器勻漿后，制得組織勻漿液。精密吸取全血0.5 mL或組織勻漿1.0 mL置于15 mL具塞塑料離心管中，加入20 μg·mL－1的CyD溶液50 μL和180 mmoL·L－1鹽酸溶液1 mL，渦旋混合1 min，加乙醚5 mL，密塞，水平固定于恒溫振蕩器上，100 r·min－1振蕩15 min，4000 r·min－1離心15 min；分取醚層置于15 mL具塞塑料離心管中，加入1%偏重硫酸鈉2.5 mL和95 mmoL·L－1氫氧化鈉溶液1 mL，振蕩（4000 r·min－1）。分取無色醚層置于5 mL具塞玻璃離心管，40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘渣加乙?水（70∶30）150 μL，渦旋混合2 min；加正己烷1 mL，渦旋混合2 min，3500 r·min－1離心10 min，棄正己烷層，血樣重復(fù)2次，組織樣品重復(fù)3次，最后一次均用0.5 mL正己烷洗滌，取下層清液20 μL進(jìn)樣。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密吸取空白全血0.5 mL或空白組織勻漿液1 mL，加入CyA系列工作液和CyD溶液各50 μL，使成濃度依次為0.05085、0.3051、0.5085、1.017、3.051、4.068、6.102 μg·mL－1的血樣及濃度依次為 0.2542、1.525、2.542、5.085、15.25、20.34 μg·g－1的組織樣品，按照“2.2.2”項下方法操作，進(jìn)樣，記錄色譜及峰面積，以Ai（CyA與CyD的峰面積之比）對濃度C作線性回歸，得到線性方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 全血及組織中CyA的線性方程和線性范圍Tab 1 Regression equation and linear rang of CyA in blood and tissues

結(jié)果表明，在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，峰面積比與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 回收率與精密度。取空白血樣0.5 mL或組織勻漿液1.0 mL，加入濃度為3、10、30 μg·mL－1的CyA溶液50 μL，按“2.2.2”項下方法操作，記錄CyA與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，以測得濃度與實際濃度之比計算方法回收率（%）。以生物樣品中CyA的峰面積與相同濃度CyA溶液進(jìn)樣后峰面積之比計算提取回收率（%）。并計算日內(nèi)及日間精密度（n＝5）。制備CyA在血液及各組織中的低、中、高濃度的生物樣品，考察生物樣本處理后室溫放置12 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

結(jié)果，低、中、高濃度血液和各組織樣品的提取回收率均大于72%，方法回收率在78.68%～108.2%之間。血液和各組織的日內(nèi)精密度小于8.6%（n＝5），日間精密度小于11.5%（n＝5）；生物樣品處理后室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定，表明此方法符合生物樣品分析的要求。

2.3 給藥設(shè)計

取小鼠120只，隨機(jī)分為20組，每組6只。實驗前禁食12 h，自由飲水。前10組小鼠按25 mg·kg－1的劑量灌胃給予Neoral溶液，后10組灌胃給予等劑量的CyA-NP膠體溶液，于給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h摘眼球取血，置于以1%肝素抗凝的EP管中。隨即頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出心臟、肝、脾、肺、腎，洗去殘余血液，去除多余結(jié)締組織，濾紙吸干，稱重。所有樣品均置于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血藥濃度和藥動學(xué)參數(shù)的測定

應(yīng)用3p97藥動學(xué)處理程序，對小鼠口服Neoral和CyANP后全血的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定口服給藥后2種制劑均符合二室模型。Cmax、tmax為實測值，AUC采用梯形面積法計算。CyA-NP和Neoral中CyA的藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表2。

2.5 CyA在小鼠體內(nèi)的組織分布

CyA-NP和Neoral經(jīng)小鼠口服灌胃后，以不同時間各組織中CyA的含量來評價2種制劑在小鼠體內(nèi)的組織分布，其小鼠各組織分布直方圖見圖2。

表2 2種制劑藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Pharamacokinetic parameters of Neoral and CyANP（n＝6）

圖2 2種制劑口服后在小鼠體內(nèi)的組織分布（n＝6）A.Neoral；B.CyA-NPFig 2 Tissues distribution of Neoral and CyA-NP after oral administration（n＝6）A.Neoral；B.CyA-NP

由圖2可見，0.5 h時CyA-NP在肝中的分布量為給藥量的4.19%，在血液中的分布量為給藥量的2.09%；而Neoral在肝中的分布量為給藥量的4.22%，在血液中的分布量僅為給藥量的1.12%。以Neoral為參比制劑，CyA-NP的相對生物利用度為162.5%。

2.6 靶向性評價

以靶向效率（Te），相對靶向效率（RTe）和靶向指數(shù)（TI）為評價指標(biāo)，考察CyA-NP相對于Neoral的靶向性。由于靶與非靶組織的質(zhì)量和容量相差較大，僅以AUC不能真實反映藥物向不同組織分布劑量的數(shù)據(jù)，因此引入AUC與各組織質(zhì)量的乘積AUQ，能更全面地定量評價藥物靶向性參數(shù)，其中血液按總重的8%計算[5，6]。AUC、AUQ、Cmax和 tmax結(jié)果見表3；以Te、RTe、TI作為評價參數(shù)，結(jié)果見表4。

由表3、表4可見，CyA-NP在體內(nèi)組織中藥物濃度分布趨勢為肝＞心臟＞腎＞脾＞肺，而Neoral為肝＞心臟＞脾＞腎＞肺；CyA-NP在體內(nèi)藥物量分布趨勢為肝＞腎＞心臟＞肺＞脾，而Neoral為肝＞腎＞心臟＞脾＞肺；腎、心臟的相對靶向效率RTeAUC、RTeAUQ，靶向指數(shù)TIAUC、TIAUQ均大于1，而肝的靶向指數(shù)TIAUC、TIAUQ接近于1。

表3 2種制劑口服后CyA在血液及組織中的AUC、AUQ、Cmax和tmaxTab 3 AUC、AUQ、Cmaxand tmaxof CyA in blood and different tissues after oral administration

表4 2種制劑口服后CyA在血液及組織中的Te、RTe和TITab 4 Te，RTe and TI of CyA in blood and different tissues after oral administration

3 討論

CyA系一種強(qiáng)親脂性多肽，與血液中各組分都有較高的結(jié)合率，且受溫度影響較大，測定時溫度不易控制，故選擇測定全血已成為共識。目前國內(nèi)、外CyA的體內(nèi)測定方法主要有放射免疫法（RIA）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）、熒光偏振免疫法（FPIA）和HPLC等[7，8]。前3種方法特異性差，多因受CyA代謝物的影響而使測定結(jié)果偏高；而HPLC法特異性強(qiáng)，測定結(jié)果不受代謝物的影響，且測定成本相對低廉。本文采用液-液萃取法對血樣及組織樣品進(jìn)行處理，通過2次萃取、多次洗滌等步驟，去除了生物樣品中的雜質(zhì)，避免了雜峰的干擾。藥物的保留時間在10 min以內(nèi)，有利于大量樣品的測定。

與Neoral給藥后比較，CyA-NP給藥后改變了CyA在體內(nèi)的分布，使藥動學(xué)參數(shù)發(fā)生變化，其中V/f（c）變小，CL（s）降低，同時AUC明顯增大，體內(nèi)生物利用度是Neoral的1.625倍。這可能由于口服給藥時納米粒可被胃腸道黏附，直接被攝取，或在特定部位釋放吸收所致。另外，CyA-NP的體外釋藥具有顯著的pH值依賴性，當(dāng)pH＞6時，CyA能從粒子中迅速并完全釋放，這樣既能減少胃腸道酶系對藥物的代謝作用，又可在腸段特定部位吸收[3]。因此，在等劑量給藥條件下，CyA-NP有助于藥物的口服吸收。

組織分布研究結(jié)果表明，與Neoral給藥后比較，CyA-NP給藥后改變了CyA在小鼠體內(nèi)的分布。由圖2可知，2種制劑在肝中的分布量最大，其次為血液，并且CyA-NP在血液中的分布量高于Neoral。0.5 h時CyA-NP在肝中的分布量為給藥量的4.19%，在血液中的分布量為給藥量的2.09%，而Neoral在肝的分布量為給藥量的4.22%，在血液中的分布量僅為給藥量的1.12%，另外，血液靶向指數(shù)TIAUC、TIAUQ均大于1，表明CyA-NP對血液有明顯的濃聚作用；在除肺外的其它組織，藥物濃度達(dá)到高峰時的時間均相應(yīng)提前，說明CyA-NP體內(nèi)分布迅速，使血液及各組織中藥物濃度較快達(dá)到峰值。

從靶向參數(shù)TeAUC、TeAUQ來看，與Neoral給藥后比較，CyA-NP給藥后對腎和心臟有一定的趨向性，且不會在肝中蓄積；而對于脾和肺，CyA-NP減少了CyA在這些器官的分布。

CyA-NP能夠提高CyA的口服生物利用度，對腎和心臟的趨向性，預(yù)示著能夠提高腎、心臟移植患者的治療效果，并且與Neoral達(dá)到相同的治療效果時所用劑量比較，本品的劑量更低，故可降低毒副作用，同時提高臨床用藥水平。

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