劉佳寧,劉一兵,賈娟娟,許文革,張雪峰,韓世泉

(中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所,北京 102413)

促黃體生成激素(Luteinizing Hormone,L H)是由腦垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種糖蛋白類促性腺激素,含219個氨基酸,相對分子質(zhì)量約30 000,由非特異的α亞基和特異的β亞基組成,L H與特異性受體的相互作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由β亞基決定[1]。促黃體生成激素受體主要存在于卵泡顆粒細(xì)胞、黃體細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上,L H與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后通過腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)刺激甾體激素生成,在受精卵著床、性腺發(fā)育及功能調(diào)節(jié)中起重要作用[2]。垂體L H的分泌受下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素的嚴(yán)格控制,隨女性月經(jīng)周期而呈周期性變化,通過刺激卵巢合成類固醇而促進(jìn)排卵和黃體生成,并促進(jìn)黃體分泌雌激素和孕激素;對男性則促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生,分泌雄激素[3]。檢測L H含量對預(yù)測排卵期、更年期綜合征、多囊卵巢綜合征、原發(fā)性不孕癥、月經(jīng)失調(diào)、子宮內(nèi)膜異位癥、性腺功能低下等生殖系統(tǒng)的生理研究、疾病診療、隨訪等具有重要意義[4]。目前L H的檢測主要有放射免疫分析、免疫放射分析、酶聯(lián)免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、膠體金試紙條、化學(xué)發(fā)光免疫分析等多種標(biāo)記免疫分析方法。其中,化學(xué)發(fā)光免疫分析具有無放射性污染、檢測范圍寬、靈敏度高、發(fā)光迅速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),近年來發(fā)展迅猛,是目前推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法之一。

本工作擬根據(jù)酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法原理,建立血清L H的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

化學(xué)發(fā)光檢測儀及其軟件:Wallac公司產(chǎn)品;GAMMA-C12γ計(jì)數(shù)器:DPC公司;1260Ⅱ型γ計(jì)數(shù)器:L KB公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

標(biāo)記單克隆抗體(L H5301)和包被單克隆抗體(L H5304):Medix公司產(chǎn)品;L H標(biāo)準(zhǔn)品抗原:ICN Biomedical公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶(HRP)、Tween-20:Sigma公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光板:購自深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司;胎牛血清:北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;發(fā)光底物:原子高科股份有限公司醫(yī)學(xué)二部提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

將L H標(biāo)準(zhǔn)品用中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定后,用滅活胎牛血清稀釋為1.5、5、15、45、100、200 IU/L,每瓶 0.5 mL 分裝凍干后-20℃保存?zhèn)溆?使用前每瓶加0.5 mL蒸餾水復(fù)溶。

2.2 固相抗體的制備

用0.1 mol/L p H9.5的碳酸緩沖液(CB)將抗L H單抗(L H5304)稀釋為5 mg/L,以每孔200μL加入化學(xué)發(fā)光板中,4℃過夜;棄去包被液,拍干,每孔加250μL封閉液(含0.4%明膠,2%丙三醇,5%蔗糖,p H 7.4),37℃封閉1 h;倒出封閉液,晾干備用。

2.3 酶標(biāo)抗體的制備

采用改良高碘酸鈉氧化法[5]制備L H的酶標(biāo)記物,辣根過氧化物酶與L H5301均為1 mg。酶標(biāo)記物于0.02 mol/L p H 7.4的磷酸緩沖液(PB)中透析過夜后加入等體積甘油,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析程序

向包被好的化學(xué)發(fā)光板中同時加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本和150μL酶標(biāo)抗體,37℃溫育1 h,棄去反應(yīng)液,用磷酸緩沖液(含0.05%Tween-20的0.02 mol/L p H 7.4)清洗酶標(biāo)板,每孔300μL,清洗4次。然后加入新鮮配制的發(fā)光底物工作液,每孔200μL,室溫靜置1 min。在化學(xué)發(fā)光儀上檢測發(fā)光計(jì)數(shù)率,以發(fā)光計(jì)數(shù)率為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),采用雙對數(shù)作圖法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合線性回歸方程,根據(jù)樣品的發(fā)光計(jì)數(shù)率,計(jì)算出血清樣品中L H的濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)建立

3.1.1 包被濃度選擇 以0.1 mol/L p H 9.5的CB將包被用的單克隆抗體L H5304分別稀釋為1、2、5和10 mg/L,酶標(biāo)記抗體稀釋為1∶1 5 000,標(biāo)準(zhǔn)品為50μL,酶標(biāo)抗體為150μL,37℃反應(yīng)1 h,觀察不同包被濃度對免疫分析結(jié)果的影響,結(jié)果示于圖1。由圖1可見,不同包被濃度下各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)發(fā)光計(jì)數(shù)率基本相同,考慮到包被板的穩(wěn)定性,選擇5 mg/L作為本分析方法的包被濃度。

圖1 L H包被濃度選擇◇——0; □——1.5 IU/L; △——5 IU/L; ×——15 IU/L;●——45 IU/L; ○——100 IU/L;+ ——200 IU/L

3.1.2 酶標(biāo)抗體稀釋度選擇 確定包被濃度后,將辣根過氧化物酶標(biāo)記的L H5301抗體分別稀釋 5 000、10 000、15 000、20 000 倍 ,觀察不同酶標(biāo)記抗體濃度對免疫分析結(jié)果的影響,以發(fā)光計(jì)數(shù)率和標(biāo)準(zhǔn)品濃度的雙對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性擬合相關(guān)系數(shù)和信噪比,結(jié)果列于表1。根據(jù)其曲線信噪比和線性相關(guān)系數(shù)選定酶標(biāo)記抗體工作濃度為1∶10 000。

表1 L H酶標(biāo)抗體稀釋度選擇

3.1.3 反應(yīng)體積選擇 確定了最佳包被濃度和酶標(biāo)抗體稀釋度后,設(shè)定不同的標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)抗體體積,37℃下反應(yīng)1 h,檢測發(fā)光計(jì)數(shù)率,以發(fā)光計(jì)數(shù)率和標(biāo)準(zhǔn)品濃度的雙對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性擬合相關(guān)系數(shù)和信噪比,結(jié)果列于表2。根據(jù)其曲線信噪比和線性相關(guān)系數(shù)選擇反應(yīng)體積為標(biāo)準(zhǔn)品50μL,酶標(biāo)抗體150μL。準(zhǔn)曲線,結(jié)果示于圖3。由圖3可得曲線線性擬合方程:y=1.059 5 x+4.235 2,相關(guān)系數(shù) r=0.999。同時平行測量10個零標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光計(jì)數(shù)率,計(jì)算 ˉx+2s,將此值帶入曲線方程,求出對應(yīng)的濃度為0.08 IU/L,此為方法學(xué)的靈敏度。

表2 L H反應(yīng)體積選擇

圖2 L H反應(yīng)時間選擇◇——0; □——1.5 IU/L; △——5 IU/L;●——45 IU/L;+ ——200 IU/L

圖3 L H酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.4 反應(yīng)時間選擇 確定了包被濃度、酶標(biāo)抗體稀釋度和反應(yīng)體積后,設(shè)定反應(yīng)時間為20 min,1、2、3、4、5 h,觀察發(fā)光計(jì)數(shù)率 ,結(jié)果示于圖2。由圖2可見,隨反應(yīng)時間延長,發(fā)光計(jì)數(shù)率逐漸增加,反應(yīng)2 h時基本達(dá)到平衡,為實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測,選擇反應(yīng)時間為1 h。

3.2 方法學(xué)鑒定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法靈敏度 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù),建立L H酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析標(biāo)

3.2.2 精密度 對L H含量為高、中、低的質(zhì)控血清分別在一次實(shí)驗(yàn)中平行多孔測定和在不同實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測定,計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù),結(jié)果列于表3。由表3可知,本方法的批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.36%、3.56%和4.09%,批間變異系數(shù)分別為5.14%、9.57%和10.23%。此結(jié)果符合方法學(xué)的要求。

表3 批內(nèi)、批間變異系數(shù)測定結(jié)果

3.2.3 健全性 將1份高濃度L H血清樣品進(jìn)行倍比稀釋后測定,相關(guān)曲線示于圖4。由圖4可得相關(guān)方程為:y=43.18 x-2.601,相關(guān)系數(shù)r=0.995。稀釋度與檢測值呈線性相關(guān),該結(jié)果符合免疫分析的要求。

3.2.4 回收率 向3份血清樣品中加入已知濃度的L H標(biāo)準(zhǔn)品,測定其回收率,結(jié)果列于表4。由表 4可知,本方法的回收率為 96.3%～112.1%,平均104.3%,符合免疫分析的要求。

3.2.5 特異性 分別用“零”標(biāo)準(zhǔn)品將高濃度FSH、TSH、HCG抗原稀釋為正常值的10倍以上,按照分析程序進(jìn)行測定,檢測其中L H的含量,換算為質(zhì)量單位,計(jì)算交叉反應(yīng)率,結(jié)果列于表5。由表5可知,本分析方法與 FSH、TSH無明顯交叉,與 HCG存在交叉反應(yīng)。

L H與 HCG屬于同一個超家族,具有相似的立體結(jié)構(gòu),二者結(jié)合于一個共同受體L H/HCG-R[7]。編碼 L Hβ亞基的基因定位于19q13.3,與 hCGβ鏈基因相鄰,hCGβ亞基有85%的序列與L Hβ亞基的前114個氨基酸同源[8],因此L H與 HCG更容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

圖4 L H酶促化學(xué)發(fā)光分析方法健全性實(shí)驗(yàn)

表4 回收率實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

表5 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.6 彎鉤效應(yīng) 配制一系列高濃度L H樣品,按照分析程序進(jìn)行測定,結(jié)果示于圖5。由圖5可知,當(dāng)血清樣品L H濃度達(dá)7 000 IU/L時,仍未出現(xiàn)彎鉤效應(yīng),但在900 IU/L處出現(xiàn)拐點(diǎn)。

圖5 彎鉤效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

3.3 方法學(xué)比較

用本方法與Beckman公司的全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)共同檢測56份血清樣本的L H含量,結(jié)果示于圖6。由圖6可知,兩種方法檢測數(shù)據(jù)顯著相關(guān),相關(guān)方程為 y=0.967x+0.068 9,相關(guān)系數(shù) r=0.975。

圖6 與Beckman公司方法測定結(jié)果的相關(guān)性

3.4 主要組分的穩(wěn)定性

3.4.1 包被板穩(wěn)定性 包被一批5 mg/L的L H5304化學(xué)發(fā)光板,封閉后分為6份,抽真空,分別于37℃溫箱放置0～15 d,檢測發(fā)光計(jì)數(shù)率,考察其穩(wěn)定性,結(jié)果示于圖7。由圖7可以看出,包被板在37℃下放置15 d,基本穩(wěn)定。

3.4.2 酶標(biāo)記抗體穩(wěn)定性 將酶標(biāo)記的L H5301抗體稀釋為1∶10 000,分裝為6份,置37℃溫箱0～15 d,考察其穩(wěn)定性,結(jié)果示于圖8。由圖8可以看出,酶標(biāo)記抗體37℃下放置10 d基本穩(wěn)定,10 d后發(fā)光計(jì)數(shù)率有所下降,但不同時間標(biāo)準(zhǔn)曲線線性及信噪比均符合免疫分析基本要求,37℃下放置15 d后,線性擬合相關(guān)系數(shù)為0.997,信噪比為8.78。

圖7 L H包被板穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)◇——0; □——1.5 IU/L; △——5 IU/L; ×——15 IU/L;●——45 IU/L; ○——100 IU/L;+ ——200 IU/L

圖8 L H酶標(biāo)記抗體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)◇——0; □——1.5 IU/L; △——5 IU/L; ×——15 IU/L;●——45 IU/L; ○——100 IU/L;+ ——200 IU/L

3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性 將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉在37℃下放置0～15 d,分別加0.5 mL蒸餾水溶解,做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)線性擬合方程計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)值,結(jié)果示于圖9。由圖9可知,高濃度標(biāo)準(zhǔn)品3 d后濃度有所下降,其余各標(biāo)準(zhǔn)品37℃下放置15 d基本穩(wěn)定。

3.4.4 試劑盒整體穩(wěn)定性 將凍干標(biāo)準(zhǔn)品、1∶10 000酶標(biāo)記抗體、5 mg/L包被板、發(fā)光液A、B分別于37℃下放置0～15 d,觀察試劑盒整體穩(wěn)定性,結(jié)果示于圖10。由圖10可知,37℃下放置15 d時發(fā)光計(jì)數(shù)率有所下降,曲線線性擬合相關(guān)系數(shù)為0.993,信噪比為9.62。符合免疫分析方法的要求。

圖9 L H標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)◇——0; □——1.5 IU/L; △——5 IU/L; ×——15 IU/L;●——45 IU/L; ○——100 IU/L;+ ——200 IU/L

圖10 L H酶促化學(xué)發(fā)光試劑盒整體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)◇——0; □——1.5 IU/L; △——5 IU/L; ×——15 IU/L;●——45 IU/L; ○——100 IU/L;+ ——200 IU/L

4 小 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)建立的L H酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法,靈敏度高、精密度好、檢測范圍寬,雖然與高濃度 HCG存在一定交叉反應(yīng),但對檢測結(jié)果無明顯影響,檢測值與國外同類試劑盒比較呈正相關(guān),各組分比較穩(wěn)定,符合免疫分析基本要求。在今后的研究中,可以通過多次細(xì)胞融合,制備出與HCG交叉反應(yīng)率小的抗L H單克隆抗體,進(jìn)一步完善本免疫分析方法。

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