余杰匡遼紅林凡勝戴俊東孫毅坤

（1北京源生素源生物科技有限公司，北京 102212；2北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，100102）

HPLC 測(cè)定復(fù)方雙花口服液中綠原酸的含量

余杰1匡遼紅1林凡勝1戴俊東2孫毅坤2

（1北京源生素源生物科技有限公司，北京 102212；2北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，100102）

【摘要】目的：建立復(fù)方雙花口服液中綠原酸的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為迪瑪C18（250×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相：0.4%磷酸－乙腈溶液（90∶10）；流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果：綠原酸在濃度 150.72～753.60 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 6），平均回收率為98.87%(RSD=0.76%)。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，精密度高，可作為復(fù)方雙花口服液的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】復(fù)方雙花口服液；綠原酸；高效液相色譜法

1 儀器與試劑

島津LC-10ATVP高效液相色譜儀；SPD-10A檢測(cè)器；chromato solutionlight色譜工作站。綠原酸對(duì)照品（由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)：110753－200212）；復(fù)方雙花口服液（自制，批號(hào)為：070408、070409、070410）。甲醇、乙腈為色譜純；磷酸為優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：迪瑪C18（250×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相：0.4%磷酸－乙腈溶液（90∶10）；流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000[2-3]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含150 μg的溶液（對(duì)照品儲(chǔ)備液在10℃以下保存）。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取復(fù)方雙花口服液樣品1 mL，置10 mL具塞離心管中，加甲醇3 mL，搖勻，冰箱中放置過(guò)夜，過(guò)夜后的藥液置2 000轉(zhuǎn)/分條件下離心15分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中。沉淀用2 mL甲醇洗滌，洗滌液置2 000轉(zhuǎn)/分條件下離心5分鐘。將兩次離心得到的上清液收集至同一容量瓶中，甲醇定容，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)。濾液作為供試品溶液。

61例患者中最短DFI為0個(gè)月，最長(zhǎng)為268個(gè)月，中位DFI為36個(gè)月。其中DFI≥36個(gè)月的31例，DFI<36個(gè)月的30例。肺部轉(zhuǎn)移瘤中，乳腺癌的平均DFI最長(zhǎng)為93個(gè)月，其次為軟組織肉瘤92個(gè)月，腎癌平均DFI為57個(gè)月，結(jié)直腸平均DFI為30個(gè)月。1年、3年、5年的生存率分別為88.4%、35.8%、15.9%，平均生存時(shí)間為28.79個(gè)月，中位生存時(shí)間為25個(gè)月。死亡患者中有32例是因?yàn)槌霈F(xiàn)多發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，另有9例因其他疾病導(dǎo)致死亡。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方藥中各藥味比例，自配不含金銀花的群藥，按其工藝制成空白制劑，再按供試品溶液的制備方法制備空白溶液。

2.5 含量測(cè)定方法

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，依外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液含量。對(duì)三批樣品綠原酸的含量測(cè)定，每批樣品取雙份進(jìn)行平行試驗(yàn)，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三批樣品中綠原酸的含量測(cè)定結(jié)果

2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，依照含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照液在此保留時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn)，即可視為無(wú)干擾。（色譜圖見(jiàn)圖1）。

2.7 線性關(guān)系的考察

精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品18.84 mg，置25 mL容量瓶中，甲醇溶液定容。精密量取對(duì)照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y＝13 969X-59 417，R2＝0.999 6，綠原酸對(duì)照品濃度在150.72～753.60 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.8 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，依峰面積計(jì)算RSD為1.43%，表明儀器的精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)070408）6份，按含量測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得平均含量為1.104 0 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.46%。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品(批號(hào)070408)適量，按供試液制備方法制備供試液，分別于配制后0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣一次，每次10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果測(cè)得RSD= 1.85%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。2.11 加樣回收率

采用加樣回收法，精密量取已知含量(1.076 3 mg/mL)同批樣品1 mL，按低、中、高3個(gè)量級(jí)（0.753 4 mg/mL,1.054 9 mg/mL,1.205 8 mg/mL）精密加入綠原酸對(duì)照品甲醇溶液各1mL，同一量級(jí)平行操作3份，按含量測(cè)定中供試品溶液的制備方法制備及上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)以上結(jié)果，表明本法具有良好的回收率。

3 結(jié)論

該制劑原含量控制方法采用的是薄層掃描法，實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)用HPLC方法測(cè)定的結(jié)果普遍優(yōu)于薄層掃描的結(jié)果。陰性對(duì)照溶液在與對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜相應(yīng)的位置上無(wú)相同保留時(shí)間的色譜峰，表明對(duì)該方法無(wú)干擾；供試品色譜峰分離好，能夠準(zhǔn)確測(cè)定綠原酸的含量；精密度RSD為1.43%，重復(fù)性好，HPLC方法操作簡(jiǎn)便，可作為復(fù)方雙花口服液的質(zhì)量控制方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)[S].WS3-366（Z-52）-97（Z）.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄114-116.

[3]鄒小娟,劉志輝,錢(qián)芳.清熱養(yǎng)心顆粒的鑒別及其綠原酸含量測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2008(59):908-910.

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

孫毅坤，男，副教授。研究方向：中藥分析與新藥研究。通訊作者 E-mail：sunyik@163.com

作者簡(jiǎn)介：余杰，男，執(zhí)業(yè)藥師，主管藥師。研究方向：中藥制劑及質(zhì)量管理。

Determination of Chlorogenic Acid in Fufang Shuanghua Oral Liquid by HPLC

YuJie1,Kuang Liaohong1,Lin Fansheng1,Dai Jundong2,Sun Yikun2(1 Beijing Yuansheng Suyuan Biolechnology Co.Ltd，Beijing 102212, China；2 Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

ABSTRACTObjective：To establish a method for determining the content of Chlorogenic Acid in Fufang Shuanghua Oral Liquid.Methods：HPLC with Dikma C18（250×4.6 mm，5 μm）column was used. 0.4%H3PO4-Acetonitrile（90∶10）as the mobile phase,flow rate was 1.0 mL/min and detection wavelength at 327 nm.Results：There was a good linear relationship at a range of 150.72-753.60 μg/mL for Chlorogenic Acid (R2=0.999 6).The average recovery rate was 98.87%with RSD of 0.76%.Conclusion：The method is simple，fast and accurate.It can be used for quality control of Fufang Shuanghua O-ral Liquid.

KEY WORDSFufang Shuanghua Oral Liquid;Chlorogenic Acid; HPLC